猪胰脂酶热稳定性的研究

dazhui · 发表于 2008-4-2 11:09:02

近年来关于脂肪酶催化酯交换反应的报道越来越多，其应用越来越广泛。但实际应用中，游离酶存在不少缺点，其中热稳定性较差是最重要的缺点之一。故从二十世纪六十年代起[1，2]，发展起来一项新技术——酶的固定化技术，与游离酶相比有显著的优点，对于热稳定性的影响较为显著。本文研究了从猪胰脏中提取的猪胰脂酶催化的最适温度和固定于猪骨头后的固定化酶的最适温度和储藏稳定性。 1 实验材料与方法 1.1实验材料猪胰脂酶（实验室自制），猪骨头（自制，乙醚处理、洗涤），橄榄油，试剂均为分析纯。 1.2主要实验仪器 PHS-3B精密pH计（上海雷磁仪器厂）、恒温磁力搅拌器（上海）等。 1.3主要实验方法 1.3.1猪胰脂酶的提取[3]。 1.3.2猪胰脂酶的固定化方法称取一定量的猪胰脂酶（5.0g）在冰浴中加入到一定体积（50ml）pH值为6.5、离子强度为0.03M的磷酸盐缓冲溶液中溶解，然后加入一定量（12.5g）的猪骨头，在0℃下搅拌1小时，离心后，用缓冲溶液洗涤。然后常温下真空干燥，放入冰箱储存备用。 1.3.3胰脂酶活力的测定方法[3]。 1.3.4猪胰脂酶的最适温度的测定将一定量的猪胰脂酶在不同的温度下按1.3.3测酶活。 1.3.5固定化猪胰脂酶热失活研究将固定化猪胰脂酶置于培养箱中，在不同温度下（30℃~60℃）保持一定时间。然后按1.3.3测酶活。 2 结果与讨论猪胰脂酶固定化前后酶活分别为1.96U和0.71U，固定化后酶活的降低主要是由于测定酶活时，酶的质量按固定化后的总量，而非酶的绝对质量。 2.1猪胰脂酶的最适温度图1 游离与固定化猪胰脂酶最适温度从图1中可以看出，猪胰脂酶在固定化后最适温度从40℃提高为55℃。猪胰脂酶在固定化后，可能是结构得到了加固，在受热时，结构变化较小，使酶的二级、三级等高级结构不易发生变化。故酶在固定化后，最适温度得到提高，其使用范围更加广泛。 2.2固定化猪胰脂酶热失活研究图2 保温时间与剩余酶活图从图2可以看出固定化猪胰脂酶在30℃条件下保存，酶活变化不大，而60℃酶活下降较为明显。其中剩余酶活（活力）指不同温度下保温的酶的酶活与未保温酶的酶活的比值乘以100。图3 保温时间与Ln（et/e0）图酶的一步失活模型方程可表示为et=e0exp（-kdt）[1，2]，变形为Ln（et/e0）= -kt，其中e0、et分别指起始酶活和剩余酶活，t指时间。用Ln（et/e0）对t作图，见图3，30℃，40℃，50℃及60℃的回归方程和相关系数分别为：Y=4.61，R2=0.998；Y=-0.0037X+4.61，R2=0.925；Y=-0.0118X+4.61，R2=0.925；Y=-0.045X+4.61，R2=0.825，以上的R2值均大于R2（0.01）（6）=0.700，故以上回归方程高度显著。通过图3可以看出固定化猪胰脂酶失活符合酶的一步失活模型。图4 保温温度与酶失活常数图通过不同温度下的（-k）对温度作图，见图4，可以清楚地看出温度越高失活越快，特别是超过50℃后。 3 结论 3.1 猪胰脂酶在固定化后，热稳定性得到提高，最适温度从40℃提高到55℃。 3.2 固定化猪胰脂酶失活符合酶的一步失活模型，当储藏温度高于50℃时，酶失活速率加快。