疑似病毒性疾病病料的采集、保存和运输

dragonli97

用于实验室诊断的猪病料的采集、保存和运输方法介绍（1）： 疑似病毒性疾病病料的采集、保存和运输 李龙* 浙江大学动物预防医学研究所, 杭州，310029 章叶恩 上海诺华动物保健有限公司，上海，200031 多病原的混合感染已经成为当前猪传染性疾病流行的最主要特征之一，导致发病率和死亡率的显著上升，带来巨大的经济损失，同时造成了临床症状的不典型，为诊断带来了很大的难度，临床上，我门已经很难简单地将几个症状组合起来就判定是什么疾病。在2006年的“高热病”风暴中，就有太多的由于误诊或诊断不及时，导致严重后果的例子。在具有丰富临床经验的兽医指导下，寻找有效的疾病控制措施的同时，很多时候我们需要对疾病进行实验室确诊。如何按照几个大类对可能感染的病原进行分类，然后针对性的采集、保存和送检病料，是实现实验室诊断的前提。临床上，往往由于病料的选择、采集方法、储存和运输方式不正确，最后送到实验室的样品无法进行检测，或导致检测结果不准确，最后延误了疾病的诊断，甚至造成误诊。本文主要介绍各种病毒性送检病料和血样的采集、保存和运输方法，为临床操作提供一些可操作性的方案和建议。在以后的文章中，我们还会具体介绍用于细菌性和寄生虫性疾病，以及其他疾病诊断的送检病料的采集、保存和运输方法。 一、用于各种病毒性疾病病原检测病料的采集和保存 以下提到病料样品，如不是直接进行实验，都需要冷冻保存（-20℃）！ 1、疑似猪瘟病例的送检病料采集 猪瘟在临床上主要表现为典型和非典型两种症状，随着我们国家猪瘟疫苗免疫的普及程度越来越高，近年来，典型猪瘟在临床上较为少见。这里主要介绍对与非典型猪瘟的病料采集方法。但是对于猪瘟的诊断，很多临床例子是采用血清学的诊断方法（一般为血凝抑制试验），来检测猪瘟抗体的水平，以此来判断猪场的猪瘟感染情况。因为通常的规模猪场都已经进行了猪瘟疫苗的免疫，因此在这里，作者必须申明，在这样的猪场，检查血清抗体的方法，只能一定程度上反映本场猪瘟疫苗免疫后的抗体水平如何、猪场的猪瘟免疫合格率多少。当然抗体水平的高低，很多时候与用于血清采集的猪的日龄有密切关系，也就 是说，如果怀疑猪场有猪瘟的问题，而随机的抽取一些发病猪的血清（血清采集方法附后），进行抗体测定，并不能说明任何问题！如果要正确诊断是否感染有猪瘟病毒，必须进行病原学诊断，相应的常用方法有两个：一个是抗原捕获ELISA，这个方法当然只需要采集血清就可以了，在实验室进行与简单抗体检测完全不同实验；另一个方法是利用PCR方法，检测病料中是否存在猪瘟病毒的基因，以此来判定是否感染猪瘟病毒。因为猪瘟病毒在扁桃体（靶器官）中的含量是最高的，因此摘取扁桃体进行检测是非常重要的，同时要取其它重要淋巴结和脾脏，必要时也可以取部分肺脏。 具体病料的采集步骤如下：①放血。从大腿内侧将皮肤、肌肉切开，直至将股东脉割断，放血至病猪休克死亡；②解剖摘取扁桃体。从胸部中线偏右处，切断肋骨，打开胸腔，在气管与肺脏连接处向前5-10厘米位置，割断气管，并顺着气管向前割开，直至咽喉部，从后向前将气管割断一半，这是就可以在舌跟靠近上颚的左右两边看到两个淋巴结，即扁桃体。小心取下扁桃体放置于干净的保鲜袋中，并做标记。③解剖摘取肺门淋巴结。一只手握住气管切断处，使劲向外拉出肺脏，另一只手帮忙扯断肺脏与身体的连接，并将整个肺脏翻转过来，使背面向上， 此时可在气管分为支气管，与肺脏连接处，找到分别位于左右两侧的两个肺门淋巴结，小心摘取，放置于另一个干净的保鲜袋中，并做标记。④肺脏样品的采集。如有必要，此时可将割取部分肺脏样品，一般只要割取介于病变和正常组织之间的部分就可以了，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。当然也可以将整个肺脏保存，但这并不是好方法。⑤解剖摘取腹股沟淋巴结。将两个后腿，向下向外压，就可以在两侧凹陷的腹股沟处中间部位，看到微微或明显隆起，即腹股沟淋巴结，小心割开皮肤和淋巴结表面的被摸，小心摘取，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。⑥解剖摘取脾脏。沿腹中线将腹部皮肤、肌肉和腹膜，小心切开并打开腹腔，在腹腔的左侧位于胃和回肠下面，找到脾脏，小心摘取，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。⑦解剖摘取肠系膜淋巴结。从腹腔的右侧位于肝脏和胃下面，找到肠系膜，在肠系膜靠近肠道的末端，可以看到很多结节，即肠系膜淋巴结，小心摘取，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。⑧流产胎儿。通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。 2、疑似蓝耳病病例的送检病料采集 猪蓝耳病的学名叫猪繁殖与呼吸综合征，顾名思义，对于蓝耳病的检测，繁殖系统和呼吸系统的病料都十分重要。同时，我们知道，蓝耳病，最大的危害是侵害免疫系统，造成免疫抑制，因此，免疫系统的病料也十分重要。 具体病料采集程序与猪瘟病料的采集基本一致（包括步骤①、③-⑥、⑧），需要强调的是，在蓝耳病的检测中，必须包括淋巴结和肺脏样本！如果是检测流产胎儿，那么，最好⑨能剪取部分胎衣液或剪取胎衣样本，保存方法同上。 3、疑似圆环病毒感染病例的送检病料采集 到目前为止，对于圆环病毒在临床上的危害，我们主要注意它免疫抑制，当然圆环病毒还能引起肠炎和繁殖障碍。因此，对于疑似圆环病毒感染的病例，病料采集包括步骤①、③-⑦。记住，在圆环病毒的检测中，必须包括淋巴结样品。 4、疑似伪狂犬病例的送检病料采集 伪狂犬病毒可危害呼吸系统、繁殖系统或中枢神经系统，因此，病料采集包括步骤①-⑧。同时，最好能够⑩采集神经系统的样品。具体步骤为用手术刀片将猪的头皮剥去，露出头盖骨，然后用凿子（也可用一字螺丝刀），轻轻凿开头盖骨，并清理骨头碎片，等整个大脑露出后，小心用手摘取，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。特别提示，因为现在使用伪狂犬疫苗绝大多数都是基因缺失疫苗（gE或gD缺失），因此血清学诊断（即鉴别ELSA检测抗体）在绝大多数情况下，可对该病进行确诊，因此血清样品对于该病的诊断必不可少！具体采集 方法见第二部分。 5、疑似乙型脑炎病例的送检病料采集 乙型脑炎病毒主要感染繁殖系统和中枢神经系统。病料采集包括步骤①、⑤、⑧、⑩。注意，乙型脑炎病毒可感染人类，特别是儿童，导致严重的脑炎，因此取病料时，请务必带上乳胶手套，并小心操作。 6、疑似传染性胃肠炎和流行性腹泻病例的送检病料采集 本病的送检病料采集，包括步骤①、⑤、⑦。同时需要⑩采集肠道样品。从腹腔中剪取病变的小肠10-15厘米，从一侧将肠道剪开，轻轻刮去肠道内容物，然后放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。 7、疑似流感病例的送检病料采集 猪流感病料采集最为简单，通常情况下，只需要用干净的脱脂棉球，沾去鼻腔液体，然后放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。当然如果认为重要也可以采集肺脏和淋巴结样品。 二、用于各种病毒性疾病病原检测病料的运输 无论是运送新鲜的病料还是冰冻的病料，保证整个过程中，病料始终处于低温状态，十分重要。一个简单的方法是，用废弃的矿泉水瓶，灌水后，放置在冰箱中，制备冰块，在病料运输时，将足量的冰块和病料一起放置在保温箱中（用冰块包裹所有病料，如果冰块不够多，最好将冰块放置在病料的上面和下面。），密封后，由专人快速运送到检测单位。 三、血清样品的采集、保存和运输 虽然血清学诊断，对于各种病毒性疾病的诊断，不能起确定作用（除了伪狂犬），但是血清学诊断对于上述诊断是十分必要的，所以只要条件允许，最好能够同时采集血样。特别指出，血液和血清是不同的概念！血清是血液的组成部分，它必须从血液中分离出来后，才能用于血清学实验，但是这种分离过程需要专业人员来操作。因此，在临床上我们采集的血样，最好在凝固后，直接送到检测单位，以保证血清学实验的正确进行。一般采血2-5毫升就足以满足实验室诊断的用量了。重点提示，用于血清学试验的血样，不能加任何抗凝血剂！ 这里只介绍三种最常规的采血方法。血样采集具体步骤如下，⑴准备好灭菌（至少是干净的，但必须保证干燥！）干燥的带盖子的塑料试管或者青霉素瓶若干；准备好专业的采血针，或者一次性注射器（1毫升或2.5毫升）。保证每个血样一个瓶子和一个针筒。⑵采血。采学前，在相应的注射器或容器上作好标记。①耳静脉采血。本法为最常用的取血法之一。将猪保定后，或由助手以手扶住头部及耳部。选耳静脉清晰的耳朵，用75%酒精局部消毒，待干。用手指轻轻摩擦猪耳，使静脉扩张，用连有针头的注射器在耳缘静脉末端刺破血管待血液漏出取血或将针头逆血流方向刺入耳缘静脉取血，取血完毕用棉球压迫止血。②心脏采血。将猪四脚向上，仰卧在地板上，固定四脚和头部，同时暴露左侧胸腔部位，探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘的正中，选心跳最显的部位，用专业的采血针作穿刺，抽取血液2-5毫升。周采血应不超过10ml为宜。 ③股动脉采血。将动脉仰位固定在地板台上，麻醉后，局部用碘酒或酒精消毒。切开长约2-3cm的皮肤，使股动脉暴露及分离。然后，用镊子提起股动脉，插入针头，轻轻抽取，血液会自动流入注射器。④直接割破股动脉，接取血液。这个方法只在上述方法都不能实现时使用，因为用该方法收集的血液，容易污染，可能无法用于进行血清分离，或分离的血清被污染，导致实验结果不准确。⑵血样保存和运送。将采完血样的注射器活塞，微微拔出一些，使针筒内留有部分空气，然后盖好针头盖子，将注射器针头向上成30度角，斜放，等待血液完全凝固（大概10分钟到30分钟），此过程中不能移动注射器，防止溶血。使用试管和青霉素瓶时也是一样。然后将样品打包，派专人立即送往检测单位。 总结，用于病毒性病原检测的病料：1）不需要完全无菌，一般只要保证清洁就可以了；2）最好冷冻保存，并保证整个运输过程的低温保存；3）不同疑似病例的病料采集有所不同；4）同时送检血样。

来自乡下的狼

用于实验室诊断的猪病料的采集、保存和运输方法介绍（2）： 疑似细菌性疾病病料的采集、保存和运输 章叶恩* 上海诺华动物保健有限公司，上海，200031 李龙 密苏里-哥伦比亚大学分子微生物与免疫系，哥伦比亚，65203，美国 上文我们介绍了在疑似病毒性疾病病例中，如何采集用于实验室诊断的猪病料方法，及其保存和运输要点。本文我们将着重介绍疑似细菌性病例的相关内容。 多病原的混合感染是当前猪传染性疾病流行的最主要特征之一。临床上多病原混合感染，通常是在原发性病原（以病毒最为常见，也包括部分细菌和其他病原，如支原体等）感染后，没有得到及时控制，继而感染了其他病原（以细菌最为常见），造成严重的、综合性的临床症状，导致死亡率迅速升高，甚至无法控制。在多病原混合感染的早期，通常只有原发性病原感染情况下，只表现为轻微的临床症状，甚至呈隐性感染过程，因此猪场往往会忽略这个过程。随着病情的发展，一些（条件性）细菌性或其他病原开始感染，随之出现一些细菌感染症状，很多猪场都会注意到这个时期，然后开始试用各种抗生素治疗，运气好的用了1-2种药物后，碰到了敏感的抗生素，病情得到了暂时的缓解（原发病原依然存在）；但是大多数猪场并没有这么好的运气，结果试了多种药物后，情况非但没有好转，反而更加严重，表现出严重的细菌感染症状，开始出现死亡，并持续加重。猪场往往会在这个时期大量用药，但这也是药物效果最差的时期。从上述过程，我们虽然没有办法归纳出多病原的混合感染的所有症状，但是从大量的临床实践来看，在多病原的混合感染的后期，通常猪场都表现为明显的细菌感染症状，且药物效果很差。因此，如何有效的控制细菌感染，往往成为很多猪场控制死亡率的关键。 临床上，猪场通常是根据不同的症状和病理表现，来判断使用何种（组合）的抗生素。如个别猪只出现发热时，我们通常会使用青霉素加退烧药；个别猪只出现咳嗽时，根据咳嗽的长短、发出声音的部位不同，常应用的一些抗生素药如枝原净，林可，庆大霉素，氟苯尼考，头孢等；个别猪只出现拉稀时，根据拉稀的不同表现，如粪便的颜色、饲料的消化程度，有无肠粘膜，气味有无腥味等我们会选择一些药物如磺胺类、沙星类、庆大、卡那霉素，土霉素等；的确很多时候，经过上述治疗后，病情就会稳定。但是由于不同猪场对疾病的判断能力不同、疾病本身表现出的新临床症状（也可能是相对不同的管理者来说）的改变、细菌耐药性的大幅提高，导致我们保健、治疗过程中不能对症下药，病情不能很快稳定、甚至蔓延，特别是在混合感染的病例中，这种用药不对症的后果，也正是造成大量死亡的首要原因。如果这个时候，我们能够进行一些甚至是很简单的实验室诊断，如细菌分离培养、药敏试验等，这样就可以知道是什么原因造成病情不能控制，通过药敏实验告诉我们什么药物敏感，通过细菌分离培养制作自家菌苗（在病情较复杂的情况下，可先制作自家组织苗，另文介绍）来控制疾病。那么怎么样才能保证实验室诊断的精确，实验室本身的诊断能力是一个方面，关键还在于采集的病料是否具有代表性，是否对采集的病料进行合理的保存和运输。 一、用于各种细菌性疾病病原检测病料的采集 由于细菌性病原很多，且同一种临床症状可由多种细菌引起，因此在下文的介绍中，我们试图根据几种具有代表性临床症状，来归纳不同情况下，用于实验室诊断的病料的采集方法。 在选择细菌性疾病病原检测病料时，要选择有代表性的病例,最好选未经抗菌素治疗的病例（最近１周未经抗菌素治疗的病例）。有条件的最好选用活体送检。 1、呼吸困难、咳嗽、打喷嚏病例的送检病料采集 导致猪呼吸困难、咳嗽、打喷嚏的原因包括病毒、细菌、环境与贫血等等。这里我们只讨论细菌感染病例的送检病料采集方法。引起猪呼吸疾病的细菌性病原体主要包括：支原体、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线菌还是、猪副嗜血杆菌、链球菌等。临床上由于猪瘟、猪繁殖与呼吸道综合征、支原体肺炎的普遍存在，导致其他细菌的感染率居高不下。因此在有呼吸疾病的猪场，采集病料时要包括上述所有细菌病原体的寄生部位。 具体病料的采集步骤如下：⑴放血。从大腿内侧将皮肤、肌肉切开，直至将股东脉割断，放血至病猪休克死亡；⑵鼻腔粘液的提取。如果是用于细菌分离目的（如药敏试验），那么最好在活体送检或现场分离的情况下，由专业人员进行鼻腔粘液的提取；其他情况下，我们不建议采用。如果采集的病料是用于病原核酸的诊断（如PCR），则可以采用：用清洁的（最好是灭菌的）脱脂棉签，伸入病猪鼻腔中，充分刮檫后，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。⑶胸腔积液和心包积液的提取。同样的不建议用于细菌病原分离目的的病料采集，最好活体送检时由专业人员进行。如果是用于病原核酸的诊断（如PCR），则可以用新的一次性注射器抽取几毫升，并做标记即可。需要注意的是，在暴露胸腔或心包腔之前，不可以污染。一个最基本的标准是除了必须用于切开胸腔或心包腔的手术器械（手术刀片或剪刀）以外， 不能接触其他任何物体，直到样品采集完成。⑷剖摘取整个肺脏。一只手握住气管切断处，使劲向外拉出肺脏，另一只手帮忙扯断肺脏与身体的连接，并将整个肺脏翻转过来，使背面向上， 此时割取部分肺脏样品，一般只要割取介于病变和正常组织之间的部分就可以了，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。当然也可以将整个肺脏保存，但这并不是好方法。⑸解剖摘取脾脏。沿腹中线将腹部皮肤、肌肉和腹膜，小心切开并打开腹腔，在腹腔的左侧位于胃和回肠下面，找到脾脏，小心摘取，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。⑹解剖摘取整个肝脏。在打开的腹腔靠近膈肌的位置，几乎完全被肝脏覆盖。从肝脏与消化道连接处，将整个肝脏提起，然后割断连接，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。⑺提取关节液。只在活体送检时采用。 2、腹泻病例的送检病料采集 导致猪只腹泻的原因同样很多，这里我们只讨论细菌性腹泻病例的送检病料采集。引起仔猪腹泻的细菌性病原体主要包括大肠杆菌、梭菌（Ａ型产气荚膜梭菌、Ｃ型产气荚膜梭菌等）、劳森菌、结肠菌毛样螺旋体、肠球菌、猪痢疾密螺旋体、沙门氏菌等。 具体病料的采集步骤包括：⑴⑸⑹。⑻提取部分肠、结肠内容物。根据各种细菌感染的部位不同提取部分肠、结肠内容物：如大肠杆菌一般感染整个小肠，回肠还是结肠无区别；沙门氏菌、梭菌及肠球菌感染整个肠道；劳森菌感染回肠；结肠菌毛样螺旋体与猪痢疾密螺旋体感染结肠。⑼剪取部分肠、结肠。也可根据上述方法，剪取不同的肠道部位，但是需要指出的是，在实际送检过程中，很难保证肠道样品免受污染，因此作者并不建议用送检部分肠道。⑽特别提示，在所有的腹泻病例中，病猪排泄物的细菌检查是十分必要的；而在大多数情况下，这种常规化验工作完全可以在当地医院的检验科完成。猪场要做的只是新鲜采集病猪排泄物样品就可以了，很多时候并没有必要送到几百里外的兽医专业实验室。 3、神经症状和步态不稳病例的送检病料采集 导致猪只神经症状和步态不稳的原因包括病毒、细菌、原虫、营养与中毒。这里我们讨论细菌性神经症状和步态不稳病例的送检病料采集。引起猪只神经症状和步态不稳的细菌性病原体主要包括支原体、猪副嗜血杆菌、链球菌、大肠杆菌、李氏杆菌等。 具体病料的采集步骤如下：⑴，⑶⑷⑸⑺。⑾采集神经系统的样品。具体步骤为用手术刀片将猪的头皮剥去，露出头盖骨，然后用凿子（也可用一字螺丝刀），轻轻凿开头盖骨，并清理骨头碎片，等整个大脑露出后，小心用手摘取，放置于一个干净的保鲜袋中，并做标记。 二、用于各种细菌性疾病病原检测病料的运输 如果是是用于细菌分离的病料，必须新鲜运送，并保证整个过程中，病料始终处于低温状态（但绝对不能结冰），保证始终无人为的污染，十分重要。一个简单的方法是，用废弃的矿泉水瓶，灌水后，放置在冰箱中，制备冰块，在病料运输时，将足量的冰块和病料一起放置在保温箱中（用冰块包裹所有病料，如果冰块不够多，最好将冰块放置在病料的上面和下面。），密封后，由专人快速运送到检测单位。如果是用于病原核酸检测的病料，则病料可以冷冻保存，同样需要并保证整个过程中，病料始终处于低温状态，保证始终无人为的污染。 三、有安排的活猪送检，是进行细菌分离和药敏试验最好的保证 无论我们如何努力地去严格执行病料采集和运送的各个程序，但病料的污染（微生物学和化学意义上的）是不可避免的，只是污染程度的不同和对结果的影响程度不同而已。这种病料的采集过程通常需要具有相当微生物和兽医学知识的人员来操作，同时还需要一定硬件条件支持。送检活猪就可以避免上述污染，但是同样需要注意以下问题。通常送检的病猪或者用于采样的病猪，至少满足以下三个条件：最好是在一周内没有经过任何抗生素治疗，病症相对整个猪场具有代表性，且病猪处于垂死状态。正是因为上述三个条件，就要求猪场在活猪送检前，与检测单位约定好时间和人员，以保证及时进行病理检查和细菌分离。因此送检活猪务必事先有充分的准备。 总结，用于细菌性病原检测的病料采集和送检需要注意以下问题。如用于细菌分离和药敏试验目的：1）需要要完全无菌，保证操作过程中无人为的污染2）最好冷藏（不可以冷冻！）保存，并保证整个运输过程的低温（不可以冷冻！）保存；3）不同疑似病例的病料采集有所不同。4）送检活猪是进行细菌分离的最好材料。如果用于病原的核酸检测：则病料可以冷冻保存和运送。 (本文来自：中国畜牧人论坛,http://www.xumuren.com )

mydream

太实用了，真是感激不尽。。。

penglin1984

总结得太丰富了，感谢分享！

志在高远

不错学习了

拒绝打折

窃喜中！！这么好居然不花钱！！谢谢楼主，您辛苦了