几种常见饲用酶制剂的酶活测定与分析

yuren925

几种常见饲用酶制剂的酶活测定与分析
1．酸性蛋白酶的测定  2。纤维素酶的活力测定 3。植物酶活力测定 4。讨论
随着生物技术的发展，酶制剂的生产成本日渐下降，越来越多的酶制剂被应用在饲料工业中，它们在提高饲料的营养价值，减少粪便排放，改善生态环境和抵抗疾病等方面均发挥了积极作用。但由于酶活的测定比较繁琐，酶活的定义、测定方法和测定条件不统一，可比性差，给广大用户在选购和使用时造成了诸多不便。而且在通常情况下饲用酶的作用效果往往需要经过一段时间（至少15d）后才能得到显示。许多不法分子利用这些因素，采用蒙骗手段销售低劣饲用酶，用户不经测定而直接使用就难免会上当受骗，造成经济损失。目前国内饲用酶制剂的生产厂很多，而真正高质量的饲用酶并不多，使得许多用户，尤其是养殖户，对酶制剂的使用效果产生怀疑，从至拒绝使用。为了扶正驱邪，本文将针对几种常用的饲用酶制剂进行讨论，简要介绍它们的一些简便的分析测定方法，供饲料生产厂和广大养殖户参考。 1.酸性蛋白酶活力的测定
1．1原理
福林试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等），它使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用这个原理可以测定蛋白酶活力的强弱。以酪蛋白为作用底物，在一定pH值和温度下，同酶液反应，经一段时间后加入三氯乙酸，终止酶的反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开。经过滤后取过滤液（含蛋白质水解产物的三氯乙酸溶液），用Na2C03碱化，再加入福林试剂使之发色。蓝色反应的强弱与过滤波中蛋白水解产物的量成正比例，而水解产物的量又同酶活力成正比。因此，根据蓝色反应的强弱可以计算出蛋白酶的活力。
1．2操作方法

1．2．1 试剂
1．2．1．l福林试剂
于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4•2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO4•2H2O）25g。水700ml，85％的磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10h，加入硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再蒸沸15min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色。若溶液有绿色，需再加数滴液溴，再蒸沸除去，冷却后定容至1000ml，过滤，置于棕色瓶中保存，此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
1．2．1．2 0.4mol／l的TCA溶液
称取三氯乙酸65.4g，加水定容至1000ml。
1．2．1．3 0.8mol／l的碳酸钠溶液
称取无水碳酸钠84.8g，加水溶解，定容至1000ml。
1．2．1．4 pH值为3.6的醋酸缓冲液
称取NaAc•3H20 16g与268ml浓度为6mol／l的醋酸溶液混合，稀释定容至1000ml。
1．2．1．5 2％酪蛋白溶液
称取干酪索20g，加入0.lmol／l的氢氧化钠20ml，在水浴中加热溶解，然后用pH值为3.6的醋酸缓冲液定容至1000ml。该试剂配制后应及时使用，或放入冰箱内保存。
1．2．1．6 100μg／ml酪氨酸溶液
精确称取在105℃供箱中烘干至值恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.lmol／l的盐酸，使之溶解，加蒸馏水定容至1000ml。该试剂配制后也应及时使用，或放入冰箱内保存。
1．2．2 绘制标准曲线
配制浓度分别为（单位：μg／ml）：0、20、40、60、80、100的酪氨酸溶液，各取lml（做4个平行样），加入不同的试管中，再各加入已稀释的福林试剂lml和0.4mol／l的碳酸钠5ml，摇匀，置于水浴锅中，40℃保温发色20min。然后在721型分光光度计上进行比色测定（波长660nm，以浓度为0μg／ml的酪氨酸反应液做空白对照）。

1．2．3 样品酶活的测定
称取酶粉5g，充分碾细，加蒸馏水1000ml，在 4O℃水中搅拌3Omin，充分溶出酶蛋白，然后过滤，滤液用0.1mol／lpH值为3.6的醋酸缓冲液稀释到一定倍数。取稀释液1ml（做平行样4个），40℃水浴预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min。然后立即加入 0.4mol／l三氯醋酸2ml，终止反应。继续置水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀，然后离心分离或过滤。取滤液lml，再加入0.8mol／l碳酸钠溶液5ml和已稀释的福林试剂1ml，摇匀保温发色20min后，进行比色测定。对照标准曲线，计算酪氨酸的释放量。
l．2．4 酶活计算
蛋白酶活力＝A×4×N／10
式中：A——对照标准曲线得出的酪氨酸释放量；
4－－4ml反应液取出1ml；
N－－酶粉的稀释倍数；
10——反应时间10min。
酸性蛋白酶酶活定义：在40℃，每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位，

2 纤维素酶活力的测定

2．l 原理
纤维素酶是水解纤维素生产葡萄糖及纤维二糖的一类酶的总称。包括C1酶、CX酶及纤维二糖酶。C1酶使天然纤维素晶体分链，成为直链纤维素。CX酶不能水解天然纤维素，但能分解直链纤维素β-1，4糖苷键生成纤维二糖。纤维二糖经过纤维二糖酶作用生成葡萄糖。测定葡萄糖的方法很多，比较简单的方法可以采用3，5-二硝基水杨酸法（简称DNS法）。3，5-H硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色。在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。但是不同来源的纤维素酶对不同的天然纤维素的分解能力也不同，即使是同一种酶，对不同的天然纤维素的分解能力也不同。为了统一标准，目前通常以羧甲基纤维素钠盐（简称CMC）作为纤维素酶作用的底物。但需要指出的是CMC无论在结构上还是在性质上都不同于天然纤维素，天然纤维素不溶于水，而CMC有很强的亲水性，非常容易被纤维素酶分解。在相同条件下，同一种纤维素酶分解CMC所产生的还原糖远大于水解天然纤维素所产生的还原糖。因此CMC酶活力只能代表CX酶的活力，而且它的数值总是比较高的，只能供作参考。
2．2 操作方法
2．2．1 试剂
2．2．1．l 二硝基水杨酸试剂
称取酒石酸钾钠91g，溶于500ml水中，再依次加入3，5-二硝基水杨酸3．5g，NaOH2Og，加热搅拌、溶解，再加入重蒸酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，加热搅拌、溶解，冷却后定容至 1000ml。储棕色瓶中，放置一周后使用。
2．2．1．2 pH值为4.6的柠檬酸缓冲浓浓度为0.1mol／l的柠檬酸溶液26．7ml和浓度为0.2mol／l的磷酸氢二钠溶液23．3ml，混合后加水稀释到1000ml。
2．2．1．3 pH值为5.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液取浓度为0.2mol／l的磷酸氢二纳溶液25．7ml和浓度为0.1mol／l柠檬酸溶液24.3m1，混合后加水稀释至 1000ml。
2．2．1．4 羧甲基纤维素钠盐溶液称取CMC 1g，加水1000ml，在水浴中加热溶解，再加入20mlpH值为5.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液和 40ml水，混匀。
2．2．1．5 500μg／ml标准葡萄糖溶液称取分析纯葡萄糖0.5g（在105℃干燥至恒重），加蒸馏水溶解，定容至 1O00ml。
2．2．2 绘制标准曲线配制浓度（单位：μg／ml）分别为：O、40、80、100、160、200、240的葡萄糖溶液。各取5ml加入到不同的试管中，再分别加入DNS试剂5ml，加热煮沸5min，取出置冷水中冷却，在721型分光光度计上比色。（波长为520nm，以浓度为0μg／ml的葡萄糖反应液体作空白对照）。
2．2．3 样品酶活的测定取纤维素酶粉5g，充分碾细，加100ml蒸馏水，与40℃水浴中，搅拌3Omin，使酶蛋白充分溶出，过滤，离心取上清液，稀释至恰当倍数。吸取稀释的酶液lml，加入 CMC溶液4ml，混匀，在40℃保温糖化30min，取出后加入NS试剂5ml，（空白样：5ml蒸馏水十 5mlDNS试剂）蒸煮 5min，取出冷却后进行比色测定，对照标准曲线计算葡萄糖的含量。
2．2．4 酶活计算CMC酶活＝（G × N）／（ V × t）式中：G――酶分解CMC释放出的葡萄糖量，μg；N――酶粉的稀释倍数；V一－反应用酶量，g；t——反Jdl时间，min。纤维素酶活定义：在pH值为5.0，40℃条件下每分钟水解 CMC释放出1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位。
3 植酸酶活力的测定

3．1原理
植酸酶能够分解值酸，释放出无机磷。选用植酸钠为酶的作用底物，通过测定无机磷的释放量可以计算酶活。目前植酸酶酶活的测定方法主要有4种，其中钒钼磷法具有较高的权威性。该方法是Gist－Brocades和BASF公司在1991年提出的，其原理是利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性钼一钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在415nm波长下测定磷的含量。以标准磷溶液（或标准植酸酶）为参照，计算酶活。该方法于1994年列入AOAC，我国已将此法的测定结果作为审批商品植酸酶注册许可证和验收产品的法定商检依据。
3．2 操作方法
3．2．1 试剂
3．2．1．1 稀硝酸溶液量取100ml浓度为65％的浓硝酸，200ml蒸馏水混合。
3．2．1．2 钼酸铵试剂称取100g铂酸铁，溶解在800ml蒸馏水中，再加入10ml 25％的氨水，定容至 1000ml，储介在暗处，保存期8周。
3．2．1．3 钒酸铵试剂称取2.35g钒酸铵NH4VO3。，溶解在 400ml水中，预热至55℃，加人20ml稀硝酸，定容至1000ml储存在暗处，保存期8周。
3．2．1．4 钒钼终止液取钼酸铵溶液和钒酸铵溶液各50ml，混合，在加入100ml稀硝酸，混合，储存在暗处，该溶液需现配现用。
3．2．1．5 醋酸缓冲液（pH值为5.5）称取三水醋酸钠30g和二水氯化钙0.167g，溶解在约500ml蒸馏水中用冰醋酸调解pH值至5.5，定容至1000ml，保存期1周。
3．2．1．6 10％氯化钙溶液称取100gCaCl2。•2H20，加蒸馏水溶解，定容至1000ml，室温储藏。
3．2．l．7 植酸溶液（底物）。称取1．4g植酸钠，溶解在200ml醋酸缓冲液中，在常温下用稀释的冰醋酸溶液调节pH值至5.5，定容至250ml（植酸钠是无水的，Sigma公司生产，分子量为1104，最终植酸钠的摩尔浓度为5.1mM），该溶液需现配现用。
3．2．1．8 磷酸储备液称取682mgKH2PO4（经105℃烘干至恒重）溶解在100ml醋酸缓冲液中。0℃－ 5℃保存。
3．2．1．9 10mM标准磷酸溶液精确吸取10ml磷酸储备液，用醋酸缓冲液稀释至50ml，制成10mM磷酸溶液。该试剂需现配现用。
3．2．2样品酶活的测定称取4g待测样品，用小磨或研钵磨成细粉。加入50ml蒸馏水，再加 1.6ml10％氯化钙溶液，搅拌溶解60min，使酶蛋白充分溶出。吸取10ml，用小型台式离心5min转速为3 000rpm），做4个平行样。离心结束后各吸取1ml，分别加入到4支试管中（2支做酶活测定，另2支做空白）。同时再准备4支试管，其中2支各加入1ml10mM的标准磷酸溶液，另 2支试管中各加入lml的醋酸缓冲液。酶样液、标准磷酸溶液和缓冲液，均在t＝0时加入3ml植酸底物，37℃水溶，在t＝60min，各加人2ml反应终止液，混合，测定各自的OD415。空白样在t＝0时加入2ml反应终止液，再加入3ml植酸底物，37℃恒温水浴60min以后测定其OD415。
ΔOD415＝样品OD415－空白OD415。
3．2．3 酶活计算
设：磷酸标准液ΔOD415为A，酶液ΔOD415为B。A＝标准磷酸液的OD415一醋酸缓冲液的OD415。B＝酶样品OD415一酶空白液OD415。设：酶粉的重量为W，稀释倍数为K，磷酸标准溶液浓度为P（单位：μmol／l）。酶粉中植酸酶的酶活（FYT／g）＝K×B×P/A×W×60植酸酶酶活定义：37℃，pH值为5．5条件下，每分钟水解植酸钠溶液释放1微摩尔无机磷的酶量为l个酶活单位，简称为 1FYT。
3．2．4 注意事项
3．2．4．1 钒酸是有毒的。其小鼠试验的半致死量LD50=18mg/kg.钼钒终止液中钒酸的浓度为0．6mg/ml，最终的比色溶液中约含有钒酸0．24mg／ml。
3．2．4．2 OD415最大不应超过0．8，若超过应作适当稀释。
3．2．4．3上述测定方法适用于样品中酶活＞50FYT／kg.
4 讨论
    日前饲料行业对饲用酶制剂的生产还比较陌生，酶活的定义和测定方法至今还没有统一.不同的生产厂家采用的标准和定义往往各不相同，许多产品说明也缺乏科学依据。事实上，饲用酶制剂的研究与应用在国外也刚开始，许多研究工作还有待进一步开发和深入。不同的日粮，需要不同的酶种。不同的动物、不同的生长期，饲用酶的添加量也不同.另外，饲用酶需要有较好的热稳定性，而这一点往往不为酶的生产者所重视。产酶菌种的选育关心的上要是酶的活力和产量。本文介绍的一些常用饲用酶制剂的测定方法也仅分析了在常温下的酶活。有关酶的热稳定性，特别是在饲料高温制粒过程中酶的活力损失需另行探讨。

韩冰

好资料，并且是免费的，顶。

米米拉撒

挺好的资料，不过有没有植酸酶的这方面的资料啊

微尘

复合酶制剂的单酶要是有国标，这个市场就不会太乱了