实验室手册

enwen · 发表于 2007-11-5 11:25:41

实验室手册

921
实验室手册
ＬＡＢＯＲＴＯＲＹ　　　ＨＡＮＤＢＯＯＫ
（兼作研究生兽医免疫学实验技术指导讲义）
焦新安　　　编
江苏农学院传染病教研组
一九九三年三月前言
实验室是进行教学和科学研究的重要基地，为适应教学、科研及实验室建设和管理的迫切需要，笔者根据教研室的教学、科研实践情况，以力求简明和实用为宗旨汇编了这本《实验室手册》，共分四个部分，其中第一、第二部分适于实验室管理和研究生等人员的实验工作基本素质和基本技能的训练；第三部分可用作研究生兽医免疫学实验指导，亦可供有关教学人员参考；第四部分是作为家畜传染病学实验课教师参考教材。整个手册反应了近年来家畜传染病教研室在教学、科研、教书育人方面的最新成果，可供同类生物学实验室交流和参考。
在编写过程中得到刘秀梵教授和张如宽教授的审阅和大力支持，室内其他同志亦提出了许多宝贵意见，特此致谢！由于时间仓促和编写水平有限，经验不足，错误之处诚望读者不吝指正。
编者
１９９０年６月
１９９０年我们试编的《实验室手册》得到了校内外读者的大力支持，并得到了许多宝贵意见，该手册正在补充修改之中，可望近期脱稿。
为了满足研究生兽医免疫学实验技术和部分家畜传染病学实验技术的教学等急需，我们稍作调整后重印部分手册。恳请读者继续提出宝贵意见！
编者
１９９３年３月
目录
第一部分实验室工作手册
第一章总则７
   附：实验室一般规则
第二章细则９
第一节无菌室工作须知９
第二节送洗须知９
第三节试剂的保存和使用须知１０
第四节菌种、毒种和细胞株保存须知１１
第五节超低温冰箱和液氮罐使用须知１３
第六节高值仪器使用须知１４
第七节常用小型仪器使用须知
第八节实验记录须知
第九节值日工作人员的职责须知
第十节文献资料查阅须知
第十一节试验准备须知
第十二节其他注意事项
第二部分　　常用仪器的操作程序及使用注意事项
第一节多功能紫外可见分光光度计
第二节酶联免疫阅读仪
第三节电子天平
第四节各类显微镜及显微摄影技术
第五节核酸蛋白检测仪
第六节各类离心机
第七节酸度计
第八节各类冰箱的使用和保养
第九节电泳装置
第十节空调机、抽湿机、超静工作台
第十一节自动颗粒制冰机
第十二节其他仪器设备
第三部分实验室常规试验程序
第一章组织培养及常用溶液的配制
第一节鸡成纤维细胞（ＣＥＦ）、鸭成纤维细胞（ＤＥＦ）培养
第二节组织培养溶液配方
第三节配制溶液注意事项
第二章淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节配合程序
第二节溶液配方
第三节单抗制作技术中的其他方法
第三章组织培养使用物品的准备
第一节一般原则
第二节玻璃器皿的准备
第三节橡皮制或塑料制品的准备
第四节其他用品的准备
第五节纯水制备程序
第六节新生犊牛血清的制备
第四章酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）的程序
第一节间接ＥＬＩＳＡ试验
第二节直接ＥＬＩＳＡ试验
第三节夹心ＥＬＩＳＡ试验
第四节竞争ＥＬＩＳＡ试验
第五节ＤＯＴ－ＥＬＩＳＡ试验
第六节酶标组化法
第七节ＥＬＩＳＡ常用溶液的配方
第八节酶标抗体的制备
第五章免疫荧光试验的程序
第一节脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备
第二节蛋白质敏化ＳＰＢＣ的制备
第三节ＰＨＡ试验程序
第七章免疫胶体金试验程序
第八章免疫球蛋白亚类测定
第一节免疫扩散法
第二节ＥＬＩＳＡ法
第九章免疫血清制备
第一节免疫球蛋白提取与纯化
第二节几种常见抗原的制备
第三节抗血清的制备程序
第十章细菌学试验种的几个常用技术
第一节细菌学总数估测
第二节几种常用培养记得配方
第三节常用细菌的分离鉴定程序
第十一章细胞免疫学试验程序
第一节玫瑰花环试验
第二节淋巴细胞转化试验
第十二章动物试验的一般规则
第十三张电泳技术、层析技术
第十部分家畜传染病学试验指导
家畜传染病学试验规则、实验报告内容
实验一炭疽的诊断
实验二巴氏杆菌的诊断
实验三结核杆菌病和布鲁氏杆菌的检疫
实验四猪瘟的诊断
实验五鸡新城疫的诊断
Ｉ鸡新城疫病病毒的鸡胚分离
ＩＩ免疫荧光实验
ＩＩＩ血凝和血凝抑制实验
实验六鸡马立克氏病的琼扩诊断
实验七沙门氏菌快速检测技术
实验八鸡白痢的检测
第一部分　　实验室工作守则
第一章总则
一、严禁在实验室内吸烟、饮食（办公室除外）；严禁挪用公物。
二、所有物品用后立即归回原处。
三、菌种、毒种严禁带出实验室。
四、各种病毒材料在废弃前应做好无害化处理。
五、爱护仪器设备，用后做好清洁整理工作。
六、使用高值仪器前仔细阅读仪器说明书，严格遵守操作规程进行操作。初次使用应在有关老师或工作人员指导下进行。
七、损坏器皿和仪器需登记，并及时向有关负责老师汇报。
八、坚持用水、用电安全，使用电炉时不得离开现场，下班时检查水电，锁紧门窗。
九、厉行节约。在一切工作中树立节约精神，培养集和各种溶液用多少配多少，可以回收的东西及时回收。节约用电，随手关灯。
十、值日人员应履行职责，并督促其他工作人员做好实验后的整理工作。
十一、实验室内所有资料阅后放回原处，一般不得带出实验室，特殊情况下需借阅，应经过批准，并登记。
十二、每进行一个试验需事先提出实验设计，列出所需材料及药品清单和经费预算（一式二份）。报请批准后付诸实施（交批准任一份）。
十三、领用或购置药品和器材需事先列出申请（一式二份），写明用途并报请批准（交批准人一份）。
十四、新进入实验室工作的研究生须经过一段时间的工作训练。熟悉实验室工作守则，掌握各种器材的清洗消毒等准备工作，掌握各种仪器的使用和保养方法。
十五、每周六下午为教研室例会（学术汇报和讨论，工作总结和安排）和室内外卫生大扫除。
附一、实验室一般规则
一、实验事是进行教学和科研的重要基地，是办好学校的基本条件之一。实验室人员应忠诚党的教育事业，认真贯彻党的教育方针，为培养四化建设有用人才尽职尽责。
二、实验室要坚持改革，按照勤俭办学的原则，少花钱，多办事，办好事，注意提高效益，反对浪费。
三、实验室以实验教学为主，在保证教学和科研任务的前提下，可以充分利用现有的技术和设备条件，积极开展技术服务工作。
四、实验室应保持肃静、文明、整洁的工作环境和良好的秩序，实验室严禁吸烟，无关人员不得进入实验室，院外人员到实验室参观学习，须经主管部门同意或院领导批准。
五、加强科学管理，建立健全必要的规章制度如各类人员的岗位责任制，仪器设备和物资材料使用报关制度等。
六、加强安全，剧毒物品要严格领用。对易燃易爆、有毒放射性等有害物品，单独存放，并且指定专人保管，严禁随意乱放和擅自挪用。
七、实验室人员和学生在实验前应做好充分准备，熟悉实验内容和操作规程，精心实验。
八、学生进入实验室学习，实验室人员应向学生进行勤俭节约、安全，以及有关科技保密等方面的教育，精心指导，确保实验课顺利进行。
九、实验人员对实验室仪器要定期清点，维护保养，开展以仪器完好率、安全、卫生等评比活动，对成绩显著的个人和集体进行表扬和奖励。对工作不负责造成损失者进行批评教育直至经济处罚和行政处分。

第二章细则
第一节无菌室工作须知
一、无菌室内非请莫入，非本实验室人员未经批准不得在无菌室内工作。
二、所有药品器材均为无菌室专用，一般不得带初无菌室，作为其他用处。
三、所有物品用后立即放回原处。
四、进入无菌室工作之前需修剪指甲，手清洗后在用１％新洁尔灭溶液洗手消毒，换鞋进入，使用超静台需着无菌室专用工作服并用酒精棉球擦手消毒。超静台每次使用后都应仔细做好清洁整理工作。
五、卫生值日人员要勤打扫。注意保持无菌室的相对无菌条件，经常用新洁尔灭溶液擦洗地面、桌面、台面和试剂厨。经常将无菌室工作服送至洗涤室清洗消毒，使用后的鼠尸及鼠笼随手带出无菌室。每日为除湿机倒水。注意无菌时使用药品、物品的消耗，及时通知工人准备，或汇报负责老师以便补充。
六、配培养基和其他试剂都应有记录，瓶子上映注明品质、浓度、日期及配制人，使用过的培养基及无菌试剂应自觉注明使用人姓名，以防止交叉污染。
七、严格控制细胞之间或病原之间的交叉污染，容易发生交叉污染的细胞或病毒不能在同一超净台内处理。
八、扭力天平使用之后应休止，在将读数盘回零，托盘及天平表面擦洗干净，药勺也应洗净擦干。使用后的药品应将盖拧紧，放回原处。
九、离心机使用时应注意平衡，使用后将离心杯、橡皮套管清洗干净，倒置晾干。
十、ＣＯ２孵箱为通气培养箱，应自觉维护箱内清洁，定期将托板、托盘换出消毒。如培养瓶内培养基漏出，立即用酒精棉讲瓶外表面迹箱内污迹擦拭干净，箱内蒸发用水威无菌蒸馏水，应注意补充。四周水箱内的水定期补加。ＣＯ２浓度、温度控制器等零部件请勿动，发现问题及时报告。
十一、组织培养用眼科剪刀镊子使用后应洗净烘干，防止生锈。
十二、浸泡细胞培养板统一使用７５％酒精（ＣＰ或ＡＲ）或医用酒精。
第二节　　送洗须知
一、送入洗涤室的所有物品均应分类置于指定的地方,以便洗涤。
二、被病原材料污染的器械物品等在送洗之前作无害化处理和面交洗涤室工作人员，并详细说明处理方法。
三、送洗的所有玻璃、塑料器皿都应冲洗后浸泡于自来水中。使用的金属滤器应仔细冲洗后，完全浸泡于水中。包扎滤器用的牛皮纸和纱布可重复使用，应置于干燥箱内烘干。
四、注意节约。可以重复使用的物品如离心管塞、牛皮纸和沙布等不应废弃。
五、注射器、针头、剪刀、镊子、微量吸样器用塑料滴头，高速离心机用塑料离心管皆由使用者自己清洗、烘干，并放回原处。
六、每一实验若需较大量的物品或一些特殊用品，应提前通知洗第室工作人员准备，特殊洗涤要求要当面交待。
第三节试剂的保存与使用须知
一、化学试剂在保存与使用过程中往往会因为自身物理化学特性和环境条件的变化发生变质。化学试剂的变质分为潮解、霉变、熔化、凝固、变色、聚合、氧化、腐蚀、挥发、风化、升华和失效等。影响化学试剂变质的主要因素为水分、氧气、光辐射和温度等。
二、化学试剂的保存温度分为室温、４℃、冰冻（－２０度）和超低温（－７０度以下）等。应根据化学试剂的物理化学特性和瓶签要求分别保存于不同温度条件下。
三、化学试剂一般都应密闭、干燥保存。有些化学试剂（如氧化钙、乙酸钾、硝酸钙和氯化钙）极易从空气中吸收水分而潮解或分解变质。这些化学试剂要特别注意密闭、干燥。有些生物制剂（如酶和荧光素）不仅需要低温保存，而且很易吸潮而变质失活。这类药品应置于干燥器中冰箱内保存，使用这类试剂要注意需待干燥器内温度升高时方可开启干燥器上盖，以防在干燥器内开成水汽。
四、根据试验要求选用不同纯度的化学试剂。不可超级使用，但也不要降级使用。（见附表）
五、使用进口药品和贵重药品需办理申请批准手续。取用时进行登记。
六、有毒药品要由专人保管，使用过程中一定要注意个人保护和环境保护。
七、所有化学试剂使用后拧紧瓶盖，立即回到原保存条件下。
八、同一种药品一瓶未用完之前不得开启或领用新瓶。
九、每一种药品使用一个药勺。注意防止试剂间相互污染。药勺使用后应立即洗净。
十、严禁将化学药品用作食用或作燃料。
附表　　我国化学试剂的等级标志
试剂级别中文名称代号瓶签颜色使用要求
一级品保证试剂或“优级纯” Ｇ．Ｒ．绿色用作基准物质，主要用于精密的科学研究和分析鉴定
二级品分析试剂或“分析纯” Ａ．Ｒ．红色主要用于一般科学研究和分析鉴定
三级品化学纯粹试剂或“化学纯” Ｃ．Ｐ．蓝色用于要求较高的有机或无机化学实验，也常用于要求较低的分析实验
四级品实验试剂Ｌ．Ｒ．棕色或蓝色或其他颜色主要用于普通的实验和科学研究上，有时也用于要求较高的工业生产中
第四节菌种、毒种和细胞株保存须知
一，菌种、毒种和细胞严禁携出实验室。其它实验室如需引进，须经过负责老师批准，并办理有关手续。
二，所有菌种、毒种和细胞都应专用登记本上按规定项目详细登记，请参阅有关登记本目录说明。
三，根据保存物不同要求保存于不同条件下。一般分为-30，超低温（-70以下）和液氮保存。
四，越低温冰箱内按位置分类存放，液氮贮罐分类存放。
五，菌种、毒种和细胞在接种继代时应严格防止交叉污染。
六，取出时必须在登记本上登记。
第五节超低温冰箱和液氮贮罐使用须知
一，超低温冰箱使用须知
1，超低温冰箱仅限于存放毒种，菌种，血清抗体、单抗腹水、药品试剂和某些病料等。
2，放入箱内所有制物品必须按规定位置分类存放。取放都应在登记本上登记。
3，箱门开启时应尽可能短暂，关门后锁紧扣好。严禁在停电时开启箱门。
4，及时清理、剔除无保存价值的物品。
二，液氮罐使用须知1，液氮容器分为二类。一类为贮存容器，这类容器保存液氮时间长，主要用于静置贮存液氮，存放时应保持垂直，切不可充装液氮后倾倒。可以空载运输，但不可在充满液氮下作长或短途运输。另一类为运输容器，这类容器耐冲击震动，可充装液氮后作长短途运输。
2，只能使用配套瓶封闭颈口，不可用其它不合格物代替。否则会因液氮持续蒸发，形成压缩气压，导致致容器的损坏或爆炸。
3，容器首次充满液氮以及停用后重装，因内胆是常温，开始充装时切勿太快，以免液氮剧烈沸腾，向外飞溅。
1、
2、容器首次充满液氮以及停用后重新充装，因内胆是常温，开始充装时切勿太快，以免液氮剧烈沸腾，向外飞溅。
3、加注液氮时不要将液氮冲在颈管上（应使用漏斗加注液氮），液氮不宜充装过满，切勿使液面高到与玻璃钢颈管接触。
4、取放冰存物时应细心谨慎操作，要注意尽量缩短颈口开放时间，避免吸入空气中水份影响贮存效果。
5、如发现液氮蒸损量突然增多或外壳上部的金属表面突然结霜，说明容器已经损坏，应立即停止使用。
6、存放细胞需使用统一规格的布袋，引绳要牢靠。
7、存放细胞后登记，并统一编号。取出细胞后也在登记薄上登记，禁止取存细胞不登记不现象。
8、保持液氮罐的线头齐整，经常清理弃去无保存价值的细胞。
第六节高值仪器使用须知
一、使用高值仪器前需仔细阅读仪器说明书。初次使用时应在有关人员指导下进行。
二、使用过程中如发现故障，应立即报告有关人员。
三、使用高值仪器必须登记，使用后做好清理工作，加盖防尘罩。
四、高值仪器由专人负责。负责同志做好仪器的调试保养和监督使用工作。
五、非本室工作人员使用高值仪器需经批准。并需由本室工作人员都督使用。
第七节常用小型仪器使用注意事项
一、电子交流稳妥压器
         1 连续工作时间一般不要超过6小时。
         2、关机后需待5分钟方可重新开启电源开关。
         二真空泵
1使用前查看没油位。以停泵时注油标中心为宜。
2、泵进气口连续通畅大气运转不得超过1分钟。
三、电动吸引器
      使用前观察润滑油是否正常（油面应在油镜中央）。若油面偏听偏低，应随时加注。
四、小型台式离心机
1、电机要三个月加注润滑油一次。
         2、碳刷磨损小于10mm时应调换新碳刷。
         3、试管、试管套都应对称平衡。严禁在重量非相等时使用。
      五、手提式高压蒸气消毒锅
1、每次使用前应检查器内水量是否保持3立升左右。
2、对溶液消毒，应灌注于耐热玻璃内，以不超过3/4瓶为妥。
3、消毒物品放置时互之间应留有空隙，有得于蒸汽穿透，提高消毒效果。
4 每次消毒开始时应将放气阀打开，待器内空气逸出，有较急蒸汽喷出时，关闭放气阀进行消毒（也可开始时先关闭放气阀待加热至5磅/平方英寸放气）
1、对器械、器皿消毒后，可立即打开安全阀，使蒸汽迅速排去。对瓶装溶液消毒终了后，                         切勿立即放蒸汽，否则，瓶内溶液可因压力聚变而剧烈沸腾、溢出，甚至瓶子爆破。
2、刚消毒后的瓶装溶液不能直接置于水泥台面，否则因骤冷易发生爆炸。
3、消毒锅盖上装有工作压力1.4千克/平方厘米的安全阀，应经常将此阀开放数次，使之处于灵活状态。
六、电热干燥箱
1、内室底板不宜放消毒物品，以免影响散热或被烤焦。
2、消毒时需开启鼓风机并适当旋开排气孔。
3、在加热过程中将加热开关旋至“2”（二组加热器工作）。达到恒温后可关闭一组加热器（旋至“1”），以免功率过大，影响恒温灵敏度。
4、加热或恒温时如欲观察工作室试品，可开启箱门，在玻璃门外观察。在温度高于100（度）时不得开启玻璃门，以防玻璃器皿骤冷炸裂。
第八节实验记录须知
一、实验记录统一用碳素水书写，要求字迹正规、条理清晰。
二、实验记录应注明年月日。
三、记录应详细。每次实验所用的材料及所采用的方法都应详细记录，以备查证。对观察的结果应作如实详尽的描述，必要时进行简单的归纳和说明。发现与预料结果不符的现象应分析原因。试验过程中发现的对试验结果有影响的意外情况诸如停电、污染等也应在记录本上注明。
四、实验记录应与实验同步进行，不要做回忆性记录。
五、试验进行一个阶段后应及时对所得的实验结果进行分析综合。提出下一阶段工作重点（实验项目及所采取的技术路线等）。
六、实验记录为本实验室拥有，一般情况下不得带出实验室。如需借用应经过批准。
七、课题结束后，记录应及时整理归档。
第九节值日工作人员的职责须知
一、完善值日制度，设专人管理。
二、值日人员应做好每天的清洁卫生工作，整理台面，检查仪器运行情况，并监督其他工作人员做好实验后的清洁整理工作。
三、注意安全工作，防盗放火防水。下班时检查水电，关好门窗。
四、无菌室值日人员的职责参见第一节，注意督促大家执行。
五、及时向负责老师汇报用完或缺少的试剂、物品等，以便补充。损坏的仪器设备，应即使报告，以免影响研究工作。
第十节文献资料借阅、复印须知
一、实验室所有的图书、期刊、文献资料等阅后放回原处，一般不得带出实验室，特殊情况下（包括外组工作人员）需借阅应经批准，并登记。
      二、复印资料，需经负责老师批准，复印后做好登记工作，避免重复复印同一份资料。
三、课题结束后，应及时整理装订好所有文献资料，交给管理人员妥为保管。
四、借阅原始记录需经有关老师同意，注意防止遗失。
五、有关文献检索的方法，请查阅有关工具书。
第十一节实验准备须知
一、首先借阅文献，写出实验设计，并经行可行性论证。
二、提交所需材料药品清单和经费预算，力求节约。
三、交负责老师批准后，方可付诸实施。
四、需要特殊材料（包括实验动物）和药品等，应提早订购。
五、新进入实验室工作的研究生须先经过一段时间的工作训练。在经行论文工作之前，必须提交开题报告。
六、阶段实验结束后，及时小结，提出下阶段的工作重点。
第十二节其它注意事项
一、配制一切试剂都应注明品名、浓度、日期和配制人。
二、操作挥发性浓酸（如冰乙酸）和挥发性有机溶液剂等应在通风有毒气体和有臭虫味气体均应在通风进行。凡是发生烟雾、有毒气体和有臭虫味气体均应在通风处进行。
三、强酸强碱等废液不能直接倒在水槽中。
四、不能用凡士林封闭层析柱下口玻璃活塞。
五、台平用后擦净，二个托盘重合以保护刀口。
六、实验台用后立即做好清洁工作。药品、试剂和器材放回原处，需要洗涤的物品送至洗涤室。
七、经常清理，剔除存放于冰箱，试剂橱内无保存价值的物品。
八、非本室工作人员借用仪器，药品和器材需经过批准，并办理借用手续。
九、工作人员之间要发扬合作精神，提倡导互相帮助。

                     第二部分       常用仪器的操作程序及使用注意事项

第一节多功能紫外可见光度计
M750—A型多功能紫外可见光光度计
在开启仪器电源之前，请检查：“光源选择钮位于”关“；”量程选择”钮位于“零”；“100%T”钮位于“零”。
1、依据待测样品选择波长。
2、根据波长选择开启H灯（200.0—360.0nm）或W灯(360.0—750.0nm),仪器预热5分钟.
3、 “量程选择”位于”校零”位置 ,用”调零”钮调零点.
4、空白样液置于光路中,盖好样品室盖,”量程选择”置于”X1”档调节”100%T”,使表头指针为”100%”.
5、重复调零和调100%步骤至仪器  完全稳定.
6、拉出手柄使待测样品于光路中, 读取A值.如样液浓度较高时可使用”X0.1”档,此时A值的读数为表头读数加1.0.
7、 “量程选择”钮位于”校零”位置,打开样品室盖取出比色皿.
8、关机：“量程选择”置于“校零”，“100%T”逆时针旋至“零点”，“光源选择”置于“关”，拨下主机电源插头。
9、将仪器用罩子罩好。
10、在使用登记本上登记。
注意事项：
1、“量程选择”钮位于“X1”或“X0.1”时不得打开样品室上盖;
2、在测量过程式中不读数，“量程选择”钮应置于“校零”位置，以延长光电管使用寿命；
3、使用权用微量池或半微量池时，应用微量进样器进液，注液时不得溢出池外，也不得碰伤上端的石英窗。
4、H灯关后间隔10分钟才可再开启。
5、比色皿用后应用去离子水充分淋洗，倒置于吸水纸上，使其干燥。
第二节酶联免疫阅读仪
DG—3022型酶联免疫检测仪使用注意事项：
1、第一次使用该机的工作人员，使用前请务必仔细阅读使用说明书；了解并掌握操作方法：    开机 —调零—工作选择（包括统计处理及其它功能）—赋值—测量必要时可在有关负责人员的指导下熟悉该
2、关机后5秒内不要立即开机，仪器正在工作时，其交流电压不允许闪动。
3、仪器工作时，操作人员不要离开。
4、仪器运行中出现失常，应即时排除故障或汇报老师处理。
5、裁下一部份打印纸带时，应使用剪刀剪的方法。
6、仪器须注意防尘防潮，加外罩。
7、更换滤光片前必须关闭电源。
第一节电子天平
Mettler  AE240电子天平
操作步骤：
1、轻按控制盘，几秒钟后显示盘显示“0,0000”或”0.00000”(“0.0000”表示量称范围0.1mg—200g,0.00000表示量称范围0.01mg—40g)。
2、如盘上显示的量程与要求的一致，则直接进入第三步，如不一致，则按如下方法改变量程范围：
（1）轻按信控制盘，待rag200/40显示后松开。
（2）再轻按控制盘一下，从显示盘上可风量程转变为另一种。
（3）几秒钟后显示器显示0。
3、在称量盘上加一块称量纸，待显示盘上读数稳定之后，轻按控制盘以去皮。
4、待显示0后，加所需称量物品。
5、稳定性检测点消失之后，显示盘上的数据即为物品的重量。
6、向上轻掀控制盘以关闭显示器，取下称量物品和称量纸。
7、用专用毛刷将称量盘和天平内室扫干净。
8、关闭天平玻璃门，罩上防尘罩，不要拔下电源插头。
9、在使用用登记本上登记。
注意事项：
1、电子天平在开启使用之前需将电源插头接到220V电源（无需稳压器）上至少30分钟，校准天平时则需按在电源上1小时。
2、电子天平在使用之后不要拔下电源插头。
3、 AE240电子天平有2种称量精确度，即0.1mg和0.01mg。没有必要时不要选用0.01mg档。
4、洒落在天平称盘和天平室上的药品务必在称量后用毛刷拭去。
5、非保养仪器人员不要擅自对天平进行校准，不合格的校准操作很容易使天平损坏。
第三节各类显微镜及显微镜摄影技术
显微镜系列使用注意事项：
1、显微镜应置于干燥、阴凉、空气流通的地方，避免受潮受热。
2、经常注意光学零件清洁，目镜有灰尘可用吹风球或软羊毛管将灰尘吹去或扫去，油浸物镜使用权用后要及时用抹镜纸醮少许二甲苯抹净油脂。
3、保持机械部份的灵活，经常上些润滑油。
4、调试好的各类显微镜，使用时请勿轻易调动，发现故障时，请及时报告负责制人员，及时排除。
5、荧光显微镜关闭后，必须间隔15分钟以上才能重新开启，用后要登记。
6、对所用显微镜（普通、倒置、相差、荧光）和显微镜摄影装置，若不熟悉，请事先详细阅读说明书，或在保管人员的指导下使用。
7、显微镜摄影装置务必在负责人员协助下进行。摄影材料应精选，注意代表性，厉行节约。
第四节核酸蛋白检测仪
ZW2080—A紫外测仪操作步骤
1、开机前，首先将电源、检测器和记录三部分电路连接，通上电源。
2、把波长旋钮旋到所需波长刻度上。
3、把主机量程开头拔到期100%T档。
4、按通记录仪电源开关，按下“调零”记录仪指针应在“0”位置，如不在，则调至“0”位。弹出“调零”按钮。按下“10mv”琴键开关。
5、打开主机电源开关。
6、顺时针旋转“光量”旋钮，使用权指针停留在50—60%T处。
7、预热1小时以上。
8、将进样器与层析柱连接，使用权层析柱中的洗脱液流经检测器。
9、当记录仪基线稳定之后，把检测器上的“光量”旋钮逆时针旋转到底，此时由于狭缝完全关闭，记录仪指针应移动到左边“0”位置。
10、顺时针方向打开“光量”钮，使记录仪指针移到90%T位置。若做透光率T测试，就可进样。
11、若用光密度A测试，把量程钮拔到所需A档，此时记录仪指针回到0.05附近,用”A调零”和”光量”钮,将指针精确调在0.05位置。
12、至此，仪器调试完毕。可以进行测试。测试过程是，“光量”、“A调零”均不能再变动。
13、测试完毕，先关记录仪开关，再关主机开关。将“光量”钮逆时针旋转到底。
14、用蒸馏水清洗样品池和要道。
15、使用情况登记。
注意事项
1、在工作前检查各连接线是否正确。
2、仪器不常工作时，有出现灯源不亮，常见原因是：（1）环境影响，因气温低或受潮；（2）久不使用等。解决办法是开通电源后，过一会儿再关掉，再开几次，或用电吹风对准灯源窗口加热。
3在连接层析柱时，避免有气泡进入样品池，当气泡进入时，应把气泡赶走，不然，基线产生波动对实验不利。
4光电倍增管为要用手指触摸发光区。
5、仪器应保持清洁、干燥。
6、层析柱使用后，柱内凝胶应及时复生。
第五节各类离心机
GL20A高速离心机操作程序：
1、主电源开关扳至“ON”位置。
2、温度预选钮左旋至“-20度”使离心室预冷。
3、已装好样品的预冷的转子正确安放在转子床上。
4、关闭离心室门盖。
5、将温度预选钮旋至“+4度”位置。
6、将速度预选钮调到所需的速度值。
7、时间预选钮调到所需的时间值。
8、按亮“BRAKE”开关。
9、待离心室温度恒定后，按启动开关，启动指示灯亮，转子开始运转。
10、当预选的时间终止时，转子自动减速。蜂鸣器叫后或速度降至“0”时，可以开启离心室门盖。取出转子。
11、将温度预选钮右旋至40度，加热化霜。
12、将速度预选取钮加零，关闭“BRAKE”开关。
13、主电源开关扳至“OFF“位置。
14、擦干离心室水汽，擦干转子水汽。
15、加防尘罩；进行使用登记。
16、
Heraeus离心机：根据实验要求选定一定的程序，设置转速、加速度、温度等数值。详细操作程序参见使用说明书。
IEC离心机、Mico持uge E离心机使用亦请参阅说明书，不再赘述。
附    614—E11    10KVA电子交流稳压器使用注意事项。
1、插上电源，开启电源开关，待遇高压指示灯亮后（需30秒至5分钟），电压表应指示220V。
2、稍许后，接上负荷。
3、关机后，需间隔5分钏才能重新开机。
4、如开机后发现调节“电压调节”钮仍不能达到220V，应立即关机进行检查。
5、本机使用权用过程中有较长时间间隔，应关机。
                                                   第七节       酸度计
PHS—20酸度计使用及注意事项
1、使用前请阅读说明书，掌握电极安装—PH校正—样品溶液PH值或电极电位的测量程序。
2、一般情况下，一天进行一次PH 校正己能懑足常规PH测量的精确度要求。
3、玻璃电极球泡很薄，操作中防止其破碎。不要用手去摸索电极球泡，以免玻璃膜沾有油脂，影响测量精度。
4、仪器在按下“读数”开关时发现指针打出刻度时，应放开“读数”开关，检查分档开关位置及其它调节器是否适当。
5、当按下读数开关，调节“定位”旋钮达不到标准绶冲溶液的PH什时，即说明书电极的不称电位很大，或被测绶冲液PH什不正确，应调换电极或溶液试之。
6、调节“温度”旋钮时勿用力过大，以防止移动紧固螺丝的位置，影响PH准确度。
第八节各类冰箱的使用与保养
1、根据物品的保存要求，选择适当的冰箱贮藏。
2、依据分类存放的原则，定箱定点放置物品。
3、冰箱内存放的物品要经常整理，没有保存价值的物品及时废弃清理。
4、冰箱要经常除霜，以保证正常、高效的运行。每天上下班，请留心冰箱工作状况，特别是低温冰箱。
5、冰箱内严禁放置食品。
6、高温季节注意冰箱的散热情况，减少开门次数和缩短开门时间。
7、经常擦拭冰箱，保持冰箱清洁工。
8、详细低温冷藏的注意到事项参见有关章节。
第九节电泳装置
一、电泳系列操作注意事项
1、进行各类电泳，如琼脂糖电泳、PAGE、SDS—PAGE、IEF、WB等时，务必事先详细设计好程序。
2、根据不同类型的电泳要求，参见有关说明书设置电泳仪的各项控制钮。
3、依据分离物质的性质不同，选定合适的电泳种类、凝胶浓度及特殊用试剂。
4、电泳过程中，仔细观察工作情况，切勿电泳过头或分离不足。
5、发现故障及时报告并排除。
6、有关详细操作程序逻辑参见有关章节及专业书籍。
二、凝胶真空干燥操作步骤
1、打开温度定时开关，预热加热板。
2、放两层Whatmann3号滤纸（或新华3号滤纸）在多孔筛板上。
3、将需要干燥的凝胶片放在一张浸湿的厚滤纸上，随后放到多孔筛板的干滤纸上。
4、用一张薄的塑料膜鲜纸（或玻璃纸）复盖在凝胶表面。用手指小心抹干，以除去气泡
5、将多孔筛板及凝胶放在干燥器的铝合金表面上放正。
6、盖上硅橡胶板，接通真空泵，重调定时开关。
7、待凝胶干好后，关掉真空泵，揭开硅橡胶，取出凝胶（己固定在滤纸上）
附：透明胶片制作方法
      下层：半透膜（可用透析袋代）
      中层：凝胶片
      上层：塑料膜鲜纸（或玻璃纸）
   注意事项：
1、一般凝胶干燥可用法80度.但为了作放射自显影或荧光摄影时应用60度烘干.
2、对于高胶连的聚丙烯酰胺凝胶,厚度较厚的凝胶或梯队度胶,要防止凝胶断裂,此时应以60度烘干为好.
3、一般凝胶在用较好的真空泵抽气时,干燥时间约为40------60分钟,在凝胶未宗全干燥之前不能打开硅橡胶板,否则引起凝胶断裂.
4、用于硝酸纤维膜的干燥,不能用加势档,仅用真空泵抽干即可,否则能引起事故.
第十节空调机、抽湿机、微波炉
一、抽湿机使用注意事项
9、经常倾云积水槽内的水，当其内的水量达到1。85公斤时，抽湿机即自动停止工作。
滤尘网至少每两星期即要清洗一次；机身用干布或沾有洗涤剂的湿布来抹拭槽橱及机身，切不可用其它化学药品洗涤。

4、不要用化学药品如汽油、挥发性油洗涤该机，或用水冲洗之。
5、厉行节约，不需要开空调机就不要使用。人离开前，切记关机。
三、 RP-63OD微波炉使用注意事项
1、微波炉内空载时，请勿使用。
2、微波炉门未关前或门关闭不良，请勿打开开关。
3、金属容器或物品切忌不要放入微波炉内，以防发生电火花损坏微波炉和容器。
4、不要用纸、布、毛制品包物品放入微波炉，以免损坏或引起意外事故。
5、微波炉使用后，可放入一杯水，以吸收余热。
6、保持微波炉内外壁、门、托盘的清洁，但切记在操作后，马上用凉水冲洗，以防破裂；微波炉使用后，应抹干内壁的水汽。
7、微波炉有故障时，切勿使用，应送专职人员检修。
8、功能选择：
Power  level Percentage/Output
High 100%/650w
M.High    70%/450w
Medium 50%/320w
Defrost 30%/200w
Low 15%/90w
第十节 KZBZ-40自动颗粒制冰机
1、该机由电子部分、制冰部分和颗粒冰推进部分组成，按程序工作。每小时可制冰5公斤，蓄冰量可达20公斤，24小时连续制冰，
2、本机为水冷散热型机组，要求通风良好，离墙和其他物之间距离应大于30厘米。
3、开机前切记检查水源是否接通，机器背面左下侧的进口用橡胶管套紧并接自来水，接好扎牢后方可打开水源（注意：进水压应在1.4-4.0kg/cm2）。
4、开启水源后，吸需打开正面的电源开关，机器就会按程序工作。若水源停止供水时，应关闭机器。
5、在制冰过程中应关闭蓄冰室门，整机在开机15分钟后方可出冰；1小时后取冰，这时的冰温度最低（-8），硬度最强。
6、机器背面右侧面有个放水口，接上一根30cm长的橡胶管引致一只存水盆收集制冷过程中的水滴和融化的冰水。
7、当蓄冰室冰满后通过电子控制自动停机，当驱除部分冰后，机器又自动工作制冰。
8、整机应保持干净，机器上面不应放杂物，严禁通电时搬动。
9、关机后，应关闭水源。当较长时间不使用时，应清理蓄冰室等部件。
第十一节其它仪器设备
一、 LRH-150B型生化培养箱使用说明书和注意事项
1、电源开关拨至“开”位置，电源指示灯亮，机器开始工作。
2、温度调整：
（1）将温度显示开关拨至“开”，数显表电源接通。
（2）将“整定”、“测量”共用开关拨至“整定”位置，然后旋转温度刻度盘，直到数显表显示出所需要的温度值为止。
3、将共用开关拨至“测量”档，
此时数显表显示温度仅仅是箱内实际温度，但此时的温度将随机器的工作状态而改变，当机器达到平衡状态，即既不加热，也不制冷时，则数显表所显示数值即为所需温度值。
电源接通后，调节好所需的温度，这时不能随便将控温旋钮来回多次旋转，以免压缩机启动频繁，造成压缩机出现过载现象，影响压缩机寿命。
4、若开机后，经过一段时间，加热、制冷指示灯均不亮，则表示箱内温度达到
平衡，等于所需温度-补偿，故加热指示灯出现闪烁现象是正常情况，但要防止两灯同时亮，否则表明机器出现故障，须即使检查、理。
4、当使用温度较低时，应定期倒掉位箱内底部接水盘内的积水。
5、箱内无需照明时，应将面板车上的照明开关置于“关”位置。
6、严禁用手或其它硬件碰撞、拉动箱内的控温探头，以免造成失控制。
7、若机器运转出现故障如控温失灵，不加热或不制冷，须先切断电源，分别检查保险丝是否完好，再检查相应部分。
二、 YXQ.G01.280手提式高压蒸汽消毒使用说明
1、首次使用必须了解消毒器内物品如何包扎——堆放——（加水）——密封——加热—— 消毒——干燥——冷却的方法，最好是在有关
人员指导下进行操作。
2 、始终应保持消毒器内有足够的水量（约2.5公斤）
3 、在消毒开始时一定要将汽阀开放，使消毒桶内的空气逸去，否则会得不到良好的消毒效果。
4 、溶液应灌装在硬质耐热的玻璃容器内，不要灌装得太满，一般灌至容器的1/2~3/4容积。
5 、不允许将不同类型不同消毒要求的物品放在一起消毒。
6 、每周将安全阀开放数次，这样可以保证安全阀处于良好的灵活状态。
7 、压力表使用日久后会使读不准确，应检修或换上新表。
8 、平时注意消毒器的清洁干燥，可以延长使用年限。
9 、消毒过程中操作者最好不要离开现场，若要离开，一定要交待他人代为看管。
10 、不同物品消毒所需时间、温度与压力：
消毒物类    消毒所需保温    蒸汽压力    表压    饱和蒸汽相
            时间（分钟）    （公斤/厘米）（碳/英寸）对温度（）
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橡胶类       15             1.05 ?1.1       15?16       121
敷料类    30?45             1.05?1.4       15?20    121?126
器皿类       15             1.05?1.4       15?20    121?126
器械类       10             1.05?1.4       15?20    121?126
瓶装溶液类  20?40             1.00?1.4       15?20    121?126
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三、其实各类仪器使用前请详细阅读使用说明书，这里不在一一介绍。

            第三部分  实验室常规试验程序
第一章组织培养及常用溶液的配制
第一节鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养
一、材料
9?10日龄鸡胚  13?14日龄鸭胚眼科剪、镊、外科镊、巴氏吸管、蛋架、灭菌平皿 25ml小三角瓶  Hanks＇液  0.25%胰酶液  Versene液  灭菌纱布、玻璃漏斗、0.1% 结晶柠檬酸（0.1M）或0.4%台盼兰,血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。
二方法（CEF为例）
鸡胚理：取9?10日龄鸡胚直  于蛋架，在气室部用于5%碘酊棉消毒，再用洒精棉脱色，用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内，去喙瓜眼和内脏，用Hank＇s液洗两次，用弯头眼科剪剪胚剪成1-2mm的碎块，加Hank’s液20ml,略加摇振，静置使组织块下沉，将混有红血球及碎片的上悬液吸去，重复洗2—3次，直至上悬液不混浊为止。
2、消化：将0.25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8，加热至37度，按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中，每个鸡胚约需胰酶5ml，30分钟取出，静置1—2分钟，吸去胰液，再加HanK’s液20ml，轻轻摇动后吸去，如此反复两三次，目的是洗去残余的胰酶。第三次加入营养液，每胚3ml左右，用粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散。静置1—2分钟，候组织下沉后，细心将细胞悬液吸出，另置一只25ml三角瓶，如此反复数次，使细胞尽量自组织块脱落，将多次取得的悬液合并一处，纱布过滤悬液。必须注意每次吹吸一般6—7次为宜，太多则细胞受损，消化时间要灵活掌握，不足细胞不易掊落，太久则细胞破碎。
在消化过程中，摇动时组织不易下沉即立即停止，消化后如组织粘连如涕，证明消化过度。
二、细胞计数：
取细胞悬液0.1（100ul）置盛有0.9ml10.4%台盼蓝的试管中混合,用血球计数板计数。
计算方法：
                  4大方格细胞数
每ml细胞数=——————————————X10（5）
                  4
            5中格细胞数
或每ml细胞数=——————————X10（4）
三：接种
以营养液配成每ml10（6）细胞（最终稀释度）接种链霉素瓶（1ml）、60ml瓶（8—10ml），100mm  dish（10ml），60mm  dish（4ml），37度孵育48小进后形成单层，接种病毒或作次代培养。
四、CEF单层可供作病毒TCID50\LD50等指数的测定,空斑计数\病毒中和试验等.
第二节溶液配方
一、PBS
1、无钙镁PBS
               50X                (Less NaCl)
1000ml             双蒸水
10g                KCl
  60g             KH2PO4
                     60g             Na2HPO4（Na2PO4.12H2O 151g）
溶后分装20ml管，-20 保存
20ml PBS    base 50X
8g    NaCl
0.3ml 0.5%酚红
980ml 双蒸水             15P 11分钟
2、NaCl    8.0g
KCl       0.2g
CaCl2    0.1g
MgCl2    0.1g
Na2HPO4 1.15g(Na2HPO4.12H2O , 2.92g)
KH2PO4    0.2g
双蒸水至100ml, 过滤除菌，50保存。
3、分别配制A、B、C原液
A液： NaCl       80.0g
   KCl       2.0g
   KH2PO4    2.0g
   Na2HPO4.2H2O    14.4g(Na2HPO4.12H2O 29.0g)
双蒸水至800ml
B液：CaCL2    0.5g
   双蒸水    500ml
C液：MgCl2    0.5g
   双蒸水    500ml
以上三液分别 10P10’高压蒸气灭菌，冷却后
A                80V
B                100V
C                100V
H2O             720V
无菌混合
注意：
各化学药品的结晶水重量是否扣除！
二Hank’s  Solution
分别配制 A、B原液
A液：NaCL       160.0
   KCl  8.0 加入800ml双蒸水
MgSO4.7H2O
MgCl2.6H2O 2.0
   CaCl2    2.8(溶于10ml双蒸水)
双蒸水加至 1000ml
B液：Na2HPO4.12H2O    3.04g
   KH2PO4.2H2O       1.2g    800ml双蒸水
   Glucose             20.0g
0.4%酚红液100ml
双蒸水至1000ml，2ml氯仿防腐，4保存。
A 1V 10P 10min 灭菌
B　　1V　　10P　　10min　　灭菌
双蒸水　　18V　　10P　　10min　　灭菌
1---4保存，可用１个月。
用5.6%NaHCO3(10P  10min  灭菌)或3.5%，调PH至7.2—7.6(加NaHCO3后须立即使用)。
三、0.4%酚红液.
称酚红0.4g→置乳钵滴加0.1N  NaOH(总量11.2g/ml)并不断研磨→所有颗粒全部溶解→100ml量瓶，将已溶后的吸入，用双蒸水洗钵数次，倒入→加双蒸水至100ml摇匀，4℃保存。
四、 Versene液
乙二胺四乙酸二钠（Versene）　　0.2克
NaCL                         8.0克
KCL                         0.2克
NaH2PO4                      1.15克(NaH2PO412H2O=2.9)
KH2PO4                         0.2克
双蒸水至1000ml,10P’,10’灭菌,4℃保存,可用3个月。
五、胰酶液Tryptase
一般配成0.25%
取0.25克溶于100mlHank’s滤过除菌,分装小瓶.-20℃保存.用前融化加入青链霉素100单位/ml并用5.6%NaHCO3滴定至PH7.4-7.6
注意:
1．为避免消化细胞成团，可配无钙胰酶液．
2．胰酶威无臭无味的白色粉末，应密封保存，阴暗处防潮解，可分装小瓶保存．
3．胰酶液的浓度随其活力和消化细胞的来源和种类而定．一般消化配组织用0.1%.
六.碳酸氢钠液
取NaHCO35.6克溶于100ml双蒸水中,使完全溶解后,经滤纸过滤后,分装于瓶中(5ml或2ml)10P,10’灭菌.塞紧胶塞,贴上标签,注明批号日期,4度保存备用.(在4度应为透明液,不得有沉淀).每瓶开启后使用不得超过2次.
七.0.5%乳蛋白水解叶(LAH)
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中,根据需要分装50-100ml瓶,立即10P,20’灭菌,4度保存备用,用前,用5.6% NaHCO3滴定PH7.4-7.5.
注:乳蛋白水解物极易潮解,平时必须将瓶塞紧,最好储存于干燥器中,乳蛋白水解物含有丰富的营养成分.0.5%乳蛋白水解物溶液加入适量抗生素和血清,即可用于一般的细胞培养.
(一).CEF培养
0.5%LAH
CS       5%
Pen       100unit
Str          100ug/ml
5.6% NaHCO3调PH至7.2-7.4
(二)PK细胞培养
0.5%LAH    89.5%
CS          10%
Pen/Str       100unit/100ug/ml
八.Earle’s液
甲液:NaCL       68g
KCL          4g
      NaH2PO4                   1.4g
      葡萄糖       10g
双蒸水至500ml,溶解后加氯仿1ml防腐
乙液:CaCL2             2.0g
   MgCL2             1.7g
0.4%酚红50ml
双蒸水加至500ml,0-4度保存备用,按比例配成Earle’s液.
甲    1V    10P 10’灭菌
乙    1V    10P 10’灭菌
双蒸水 10V    10P 10’灭菌
4度保存备用,用前用5.6% NaHCO3调PH至7.4-7.5
九.抗菌素溶液(Pen/Str)
用灭菌双蒸水配制每毫升含
Pen(青霉素)10,000units
Str(链霉素)10,000ug
分装小瓶,-20度保存.一般培养液加这种Pen/Str%,最终浓度为100unit/ml.
十、199—F10生长液
199       5.49g（4.95g）
   F10       4.9g
   NaHCO3    1.7g
   S.P          1ml(10万U/ml)
   BFS       40ml
   DDW       至1000 ml
过滤后分装备用.
199---F10维持液:BFS仅用10ml,余者同上

            第三节配制溶液的注意事项
1使用化学药品为A.R.级,标签清楚,最好组织培养专用,防止使用和保存过程中的混淆和污染.
2.配制溶液的用具,需经严格洗刷和消毒,其配制过程尽量在无菌操作下进行.
3.称量药品应力求精确.配制溶液应有详细记录以及消毒，保存,分装和使用情况.
4.配制的每批溶液,需经试用后,方可大量使用.因此需提前配制溶液.溶液保存有一定期限,保存时应经常检查,发现可疑现象和过期,不得使用.
5.注意节约,计划用多少就配多少.
  第二章  淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节融合程序
融合方法:
1、将108 脾细胞与2—5x107 SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中，加入30mlDMEM基础液；
2、 1000r/m离心5分钟；
3、吸净全部培养液；
4、在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块，置400C水浴中预热；
5、用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50%PEG（PH8.0）1ml，边加边搅；
6、用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟；
7、 1000r/m5分钟；
8、弃尽上清，轻击离心管底以分散细胞积块，重新悬浮于80—100mlHAT培养基中；
9、按比例加入107  —2X77  腹腔细胞（约2只小鼠）；
10、分装96孔细胞培养板，每孔0.10__0.15ml；24孔板，每孔1.0__1.5ml;
11、 7.5%CO2,37℃孵箱里培养;
12、 5天后HAT培养基换出1/2培养液;
13、 7__10天后用HT培养基换出HAT;
14、经常观察杂交瘤细胞生长情况,待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测.
15、其它详细资料请参阅刘秀梵教授编<<单克隆抗体及应用>>.
第二节溶液配方
一、基础培养液：
1、老配方    DMEM       13.37g+1000ml双蒸水使之溶解
            丙铜酸钠       0.11g
            碳酸氢钠       3.6g
            pen/str          20万/2
0． 22u过滤，分装，4℃保存（不超过1个月）
2、新配方    DMEM基础液：
            四蒸水          980ml       NaHCO3    3.7g
            DME(Giboo)    13.37g    S.P(100X)10ml(本实验室用1支庆大霉素)
1NHCl调试PH至7.2_7.4(本实验室用1NnaOH调至7.2_7.4),过滤除菌,分装后4℃保存.
3、 DMEM完全培养基：
   30mlDMEM基础液中加15-20ml BFS，1mlL-G（100X）即为完全培养基。
4、 HT培养基
100mlDMEM完全培养基中加入100X HT 1ml即成，或按下列配方直接配制：
         四蒸水             980ml
         DME（Giboo）       13.37g    L.G(100X) 10ml
         HT(100X)          10ml    BFS(NCS) 150_200ml
         NaHCO3             3.7g       S.P(100X) 100ml
用1NHCl调至7.2_7.4, 过滤除菌,分装后4℃保存。
二、 100Xaminopterin（4x10（-5）M  MW=440.4）
1.76mg A+90ml双蒸水+0.5ml 1N NaOH助溶，双蒸水加至100ml+0.5ml 1N HCl中和,0.22um滤膜过滤除菌,分装2ml小瓶,-20℃保存。
三、 100XHT
Hypoxanthine：MW 136 10（-5）M solution
Thymidine： MW242.2 1.6X10(-1)M solution
H和T可以配在一起，136.1mgH+100ml双蒸水+1N NaOH至H溶解,加T38.8mg,把PH用醋酸调至9.5, 0.22um滤膜过滤除菌,-20℃保存。
四、 100Xglutamine 200Mm  Solution
2．92g       glutamine
100mlDMEM基础液，,37℃助溶液
0.22um滤膜过滤除菌,分装2-5ml小瓶，-20℃保存。
五、融合剂配制：PEG（Baker 1000）20-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青链霉素小瓶中，高压蒸汽灭菌，-20℃保存备用。临用前加热融化，加等量DMEM基础液，用少许5.6%NaHCO3调PH至8.0。
第三节单抗制备技术中的其它方法
一、杂交瘤细胞的克隆化
1、制备小鼠腹腔细胞；
2、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液；用不着5-20%血清的HT培养基稀释后使每毫升含2.5、15、50个细胞3种不同的稀释度。
3、按每毫升加入5X10（4）-5X10（5）个细胞的比划，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔细胞；
4、每种杂交瘤细胞分装货6孔板一块，每个稀释度32孔，每孔的量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞分别为0.5、3、10。（或将士、3、4步改为配制15毫升HT培养基中含100个细胞，加入腹腔细胞后分装96孔1块）；
5、 37℃，7.5%CO2湿润培养基7—10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；
6、在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测；
7、取阳性的细胞扩大培养，并冻存。
二、细胞冻存和复苏方法
1、将对数生长期的杂交瘤细胞或其它细胞离心，重新悬浮于预冷的冻存液中（其中含10—20%小牛血清，10%DMOS的HT培养基），浓度至少5X10（6）/ml。
2、分装安瓶，每瓶1ml，置水浴上。
3、封口后，将发瓶入入一带收口绳的小布袋内，立即将布袋放入内衬石棉的百铁筒内，置—70℃冰箱。
4、 2—4小时后，或过夜后，将布袋移入液氮罐。
注意：在—70℃保存时间不宜过长，一般不超过24小时。
5、复苏细胞时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴中融化，待最后一点冰快要融化时，从冰浴中取出，置冰浴上，用5—10mlHT培养基稀释，离心后，再悬浮于适量培养基中，装瓶，置37℃含7.5%CO2培养箱中培养。
6、如细胞存活率不高，可加腹腔细胞进行培养。
7、细胞存取均应为高，可加腹腔细胞进行培养。
8、细胞存取均应做好记录。
三、单抗的大量生产
1、腹腔接种降植烷（Pristane）或液体石腊，每只小鼠（2月龄以上）0.5ml.
2、7—10天后腹腔接种PBS稀释的杂交瘤细胞，每只鼠5X10（5）/ml0.2ml。
注意：每只鼠接种细胞数不可太多或太少，否则单抗菌素产量不高。
3间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨起，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2—3次，通常每只小鼠可采5—10ml腹水。

5、离心，去除细胞成份和其它沉淀物，测定抗体效价，可加防腐剂（0.01%硫柳汞或者说%叠氮钠）小量分装,—70℃保存。
                  第三章组织培养使用物品的准备
1、器材用后立即浸泡是很重要的事；
2、分类洗涤、处理是必要的，不妨可分为不与细胞直接接触的器材和与细胞直接触的器材，它的洗刷条例不尽一致；
3、厉行节约，可以重复使用的器材不应废弃；
4、需要特殊处理的器材，如病原材料污染的器材物品，须协助洗涤人员作无害化处理；
5、高压消毒或高温干烤器械时，务必有人在场。
第二节玻璃器皿的准备
1、规格：组织培养用的玻璃器皿要求严格，以中性硬质玻璃为适宜，用于培养细胞的培养瓶更应注意选择，一般常用的细胞培养瓶有链霉素瓶，方形、园形克氏瓶等。蜕2瓶的接种面应平坦，瓶口内径力求光滑或正方形，防止瓶塞塞后漏气。其它培养中弯头吸管、试管、盛液瓶、平皿、吸管和注射器一般常用即可。
2、洗涤
用过的玻璃器皿，先用清水冲洗，再以肥皂或中性洗衣粉水洗干净，浸泡于洗涤液中1—2日，取出后自来水冲洗7次，再用双蒸水或去离子水三盆，分盆冲洗5次，并在双蒸水或去离子水中浸泡过夜，晾干或烘干，包装消毒。新购置的玻璃器皿在25%的浓H2SO4或3%的稀盐酸中浸泡过夜，再进行以上洗涤、晾干、包装、消毒。
3、包装、消毒
小培养瓶或链霉素瓶可放在普通铝制盒中，吸管在塞上棉塞后放在玻璃或金属筒中消毒。盐水瓶用牛皮纸包口后，160℃2小时，干热灭菌。
第三节橡皮朔料制品的准备
1、规格：
选用质软能耐高压，对细胞毒性小的橡皮塑料制品。
2、洗涤：
新的橡皮塞和橡皮管首先在1%NaOH中煮沸30分钟，然后用自来水冲洗5—7次，用双蒸水冲洗3次，再用双蒸水浸泡过夜色。用过的橡皮塞洗净后，以双蒸水煮沸30分钟，晾干，包装消毒。
3、包装灭菌：
将洗涤、晾干的橡皮塞放在小铝盒内或培养皿内。其它橡皮制品用纸包好，15P20—30分钟。
第四节其它用品的准备
一、滤过用布：指麻布或娟布，剪成小块，浸于丙酮中，在室温经48小时，取出洗涤，以双蒸水洗3次，干燥灭菌备用。
三、解剖用具：外科剪、镊等，可用干燥灭菌，160℃2小时或于使用前煮沸消毒
5—10分钟，每次用完后洗涤擦干。
附1 洗液配方
      配方1 重铬酸钾       150g
               蒸馏水       300ml
               浓硫酸       30000Ml
      将重铬酸钾沸水溶解，然后慢慢加入浓H2SO4，边加边搅拌，见发热过剧则稍停，冷却后继续加，此为强洗液。
      配方2 浓硫酸    50%
               蒸馏水    50%
               重铬酸钾 5%
      此为中等强度洗涤液
      配方3 重铬酸钾    100g
               蒸馏水       1000ml
      加热溶解，冷却后缓慢加入工业硫酸100ml，此液为弱洗液，为棕红色，使用此液时，必须预热先用肥皂水将玻璃器皿洗净，经自来水冲洗沥干，然后才能浸入，否则该洗液很快失效。
      盛洗涤液的容器要坚固，操作时要穿橡围裙，长筒胶靴，戴上眼镜和厚橡胶手套，以保安全。
      洗涤一旦变绿，表示铬酸已经还原，失去了氧化能力，不宜再用。如将这样的洗液加热，再加适量重铬酸钾，可重新使用。
附2、玻璃器皿的硅化处理可以防止细胞粘附或提纯物质损耗在离心管可吸管上。下述的是溶硅的操作条例。
1、工作液由1份硅胶加100份水制成。如要硅化大约24个15ml的离心管和200个用后便丢弃的巴氏吸管时，可准备600—800ml的工作液。
2、在硅化前所有玻璃器材必须清洁和干燥，将溶液倒入离心管，放置至少5分钟。倾出，水冲洗2—3次。将巴氏吸管放满一个大烧杯，将硅胶倾倒在它的上面，直至所有吸管都有充满为止。放置至少5秒钟，将溶液倾出，用水彻底冲洗吸管。工作液不可再用。
3、室温中气干器皿24小时，放入玻璃器皿干燥箱内，时间可较短。
第五节纯水制备程序
1、细胞培养用水必须使用三蒸馏或四蒸馏水，而大多数去离子水和常规一次蒸馏水一样不适于作为与细胞接触之用。
2、四蒸水的制备，通常用去离子水，在双重石英蒸馏器中蒸馏2次，以达到纯净的目的。
3、去离子水通常用一次蒸馏水，经离子交换树脂处理，并检查水质情况：水质清亮，一般电阻大约10万欧姆/cm，最高可达100万欧姆/cm；5%AgNO3检不出氯离子，PH8—10。
4、离子交换柱必须安装在环境温度最高不超过40℃，最低不能低于0℃地方。
5、新树脂预处理方法：
（1）工业性生产的离子交换树脂出厂时难免有一些杂质，在使用前应先用清水冲洗，洗至水质清亮。
（2）用4%HCL、4%NaOH（浓度不能超过6%）交替处理，在酸碱之间大量水洗，如此反复处理三次，即：酸一水，碱一水，反复进行，每次酸碱用量为树脂体积的2倍。在交换柱中动态进行，如在容器中处理应采取少量多次。
（3）最后一次，阳性树脂应用酸处理使其成为H 型，所用酸量应加倍，水洗手去离子水。阴性树脂应用碱处理使其成为OH型，所用碱量应加倍，水洗用去离子水。
6、经常以4—5%HCL再生阳性离子柱，（001X7强酸树脂）用量为树脂体积的2—3倍。以
   4—5%NaOH再生阴离子柱。（201X7强碱树脂）。

            附：A实验室用纯水质量表

精制方法
精制水的电阻率（欧姆.厘米）
纯水的理论值
蒸馏水
玻璃容器一次蒸馏
玻璃容器三次蒸馏
石英容器三次蒸馏
石英容器23次蒸馏
复床式
混合床式
1.83X10（7）
1.0X10（6）
5.0X10（5）
1.0X10（6）
2.0X10（9）
1.6X10（7）
1.0X10（4）
1.8X10（7）
         附B实验室分析用水标准
序号

项目
指标
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 外观
PH
蒸发残渣（mg/l）
灼烧残渣（mg/l）
氨及铵盐（NH4）（ng/l）
碳酸盐（CO2）（mg/l）
硫酸盐（SO4）（mg/l）
氯化物（CL）（mg/l）
硝酸盐（NO2）（mg/l）
硅（mg/l）
钙+镁（mg/l）
重金属（mg/l）
导电率（Ω）无色透明，无臭无味
5.4—6.6
<5
<1
<0. 05
<0.2
无
无
无
无
<0. 1
无
8X10(-6)—5.8X10(—8)

第六节新生犊牛血清的制备
1、胎牛或出生24小时风的新生犊牛适用。
2、将小牛确实保定于手术台上，注意头部的保定；剪去颈部胎毛，充分暴露颈静脉部位，以碘酒棉球、酒精棉球消毒手术部位。
3、沿颈静脉上缘切开皮肤，钝性分离其下各种软组织，暴露颈动脉。
4、仔细分离颈动脉一侧的迷走神经，驳去动脉管上的包膜。
5、在远心端和近心端用止血钳夹住颈动脉管，以手术刀尖切开动脉管，向心插入导管。
6、收集血液前，去掉近心端的止血钳，弃掉起先流出的几滴血，然后小心插入收集血瓶内，注意导管沿瓶壁放血，同时减少摇动收集瓶的次数。
7、待血液凝固，血清析出弃分后（但时间不能太长，特别是室温较高时，以免溶液血），离心分离血清。
8、以0.22U微孔膜过滤血清,分装,标明制备日期,制备人.
9、于56(度)灭能30分钟,做法是将血清入水浴箱后,然后将水浴温度调至56(度),温度达到56(度)时,计时30分钟.。
注意：不要先将水浴温度调至56（度）再灭能血清，这样时间无法计算。
10、待血清冷却后，置于20（度）冰箱保存备用。
第四章酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序
第一节间接ELISA试验
一用可溶性抗原的ELISA：
1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；
2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；
3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；
4、 PBST洗三次；
5、每孔200ulPBS/NCS  4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；
6、 PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）
7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；
8、 37（度）孵育2h
9、 PBST洗5次，每次5min
10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；
11、 37（度）孵育2h
12、 PBST洗5次，每次数5分钟；
13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul
14、 37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；
15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；
16结果判定：
（1）P/N≥2.1       为阳性
  (2) P≥N+3SD       为阳性
  成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。
二、用全菌抗原的ELISA法
（一） GA法
1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。
注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；
2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M  NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时
3、蒸馏水洗5次;
4、加细菌悬浮液,50ul/孔;
5、 37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)
6、加PBS/NCS  220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；
7、 PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；
8、以下步骤同一。
（二） MA法
1、细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；
2、室温或37（度）干燥吸附；用甲醇（MA）固定；室温10分钟；
3、加PBS/NCS封闭，37（度）3小时或4（度）过夜；
4、 PBST洗5次（于—20度或4度保存备用）；
5、以下步骤同一
成功范例：H单抗检测等。
三、用全细胞抗原的ELISA
1、按常规方法培养细胞，接种病毒，收获感染细胞和未感染的细胞，进行细胞计数，用PBS制成适当浓度悬液；
2、加100ul/孔细胞悬殊浮液于酶标板内，使每孔含细胞5X10（）
3、将板离心1000rpm10分钟，甩去上清，室温干燥（可保存在4℃或—20℃备用）；
4、 PBST冼3次，每次5分钟；
5、每孔加100ul第一抗体或杂交瘤上清，设立对照；
6、 37℃1—2小时；
7、 PBST洗3 次；
8、每孔加入100ul酶标第二抗体，37℃1—2小时；
9、 PBST冼5次；
10、每孔加入100ul底绶冲液，室温作用30分钟；
11、判定结果。
      成功范例：粘附素单抗，O抗原单抗检测等。
      注意：若需要，可灭活细胞内源酶，以减少本底反应。其它方法参见本章第六节。
第二节直接ELISA
1、可溶性抗原或全菌抗菌素原（用量以方阵试验确定）包被标板（50—100ul/孔）；
2、PBS/NCS封闭板（保存备用）；
3、每孔加50—100ul酶标抗菌素体；设立阴性、阳性对照；
4、 37℃孵育2h
5、 PBST洗5次，每次5分钟；
6、以下同间接ELISA；
  成功范例：沙门氏菌检验、抗血清效价测定、酶标抗体效价测定等。
第三节夹心ELISA试验
1、单一或混合单抗腹水或纯化的免疫血清用包被液稀释后25—100ug/ml；（有人使用蒸馏水直接稀释腹水作包被）。
2、以50—100ul/孔量加入酶标板中；
3、置4℃过夜吸附或37℃吸附3h
4、 PBST 洗3次；
5、 PBS/NCS封闭，200ul/孔，4℃过夜或37℃3h；
6、 PBST洗涤5次，每次1min；（可于—20℃保存备用）；
7、每孔加50—100ul待检抗原，同时设立阴、阳性对照；
8、 37℃孵育2h；
9、 PBST洗5次，每次5min；
10、每孔加50—100ul酶标单抗或酶标纯化抗体；
11、 37℃孵育2h；
12、 PBST洗5次，每次5分钟；
13、 37℃孵育2h
14、 PBST洗5次，每次5min；
15、以下步骤同前。
      成功范例：鸡新城疫病毒，大肠杆菌，沙门氏菌检测。
第四节竞争ELISA试验
1可溶性抗原以包被液稀释至1ug/ml（需方阵滴定确定），（全菌抗原包被方法参见前述）；
2、50—100ul/孔，包被酶标扳；
3、4℃过夜吸附；
4、PBST洗3次。每次5分钟；
5、PBS/NCS封闭200ul/孔，37℃3hr或4℃（保存备用）；
6、PBST洗3次，每次5分钟（可—20℃或4℃保存备用）；
7、加50—100ul/孔待检血清样品，再加入50—100ul/孔单抗，设立对照；
8、 37℃孵育1—2h；
9、 PBST洗5次，每次5分钟；
10、每孔加OPD50—100ul；
11、 37℃避光作用10—20min；
12、以100ul/孔加2M H2SO4终止反应，测定OD490；
13、判定结果：
（1）抑制率（N—P/N）》50%判为阳性；
（2） OD490值《NCX  Ⅹ0.3+PCX X    0.7为阳性(PCX为阳性对照的平均值,NCX为阴性对照的平均值)。
成功范例：检测伤寒、鸡白痢抗体等。
第五节 Dot—ELISA
1、根据实验要求不同，选用硝酸纤维膜，混合膜或醋酸膜，并切成条带，以硬模压痕迹；
2、以蒸馏水或TBS浸泡膜条带，取出晾干后备用；
3、抗原包被：
（1）、可溶性抗原（ug/ul），每点点加5ul，37℃烘干；
（2）、全菌抗原（1X10（6）/ml），每点点加5ul；37℃烘干，可先将条带经5%GA处理后，37℃3h或4℃过夜，再加样烘干。
4、 TBS/NCS或BSA封闭；
5、漂洗；
6、将膜转入酶标抗体内，37℃0.5-2h;(间接法步骤是:先于第一抗体中浸染漂洗后，转入酶标第二抗体中反应)。
7、漂洗；
8、把膜置入DAB或4—氯—1—萘酚底物中显色，室温10—30分钟；
9、漂洗；
10、晾干后，判读结果（可以进行扫描分析）。
成功范例：脂多糖抗原检测，大肠杆菌检测，单克隆抗菌素体筛选等。
第六节酶标组化法
1、抗原准备：
（1）细胞涂片：
（2）病变组织触片或冰冻切片；
（3）生长细胞的培养孔或玻片；
2、 4℃丙酮固定10分钟；
3、灭活内源酶：
将待检玻片浸入内源酶灭活液内，或于培养孔内加入内源酶灭活液，室温灭活30分钟，弃去灭活液，以PBS和去离子水充分洗涤10—20分钟，自然干燥；
4、以PBS/NCS封闭，37℃2小时或4℃过夜；
5、酶染：加酶标抗体反应（或间接法步骤进行）37℃1—2小时，并设立对照；
6、 PBS洗15分钟表；
7、以DAB显色，室温避光30分钟；
8、镜检：细胞浆呈棕黄色，细胞核无色，阴性对照无色，判为阳性。（4—氯—1—萘酚显色）。
成功范例：猪瘟组化法诊断。
第七节 ELISA常用溶液的配方
一、包被液
1、碳酸盐绶冲液
0.2M  Na2CO3: 12g无水Na2CO3+100ml去离子水
0.2M NaHCO3：1.68g  NaHCO3+100ml去离子水
取0.2M  NaCO3：8ml，0.2M  NaHCO3:17ml混合再加75ml去离子水,调PH至9.6。
2、 Tris—HCL绶冲液（PH6.0,0.02M）
0.1N    Tris       100mｌ
0.1N    HCL       58.4ml
培养离子水加至1000ml
(Tris MW       121.14)
3、其它包被方式，如（GA、MA、BSA等方法，请参阅有亲章节和文献。
   二、稀释和封闭液
1、 EPBA（PH7.2）
NaCL    80g          Na2HPO4.12H2O    14.5g
KCL       2g          KH2PO4                      2g
去离子水10升
2、 EPBS/Tween—20/NCS：
EPBS+0.05%Tween—20+10%NCS  or  ！%BSA
      3、Tris—HCL绶冲液       PH7.0 0.01M
               0.1M  Tris    50.0ml
               0.1N HCL    46.5ml
               NaCL          8.5g
               BSA             50g
               正常山羊血清150ml檬酸:
               去离子水1000ml
   三、洗涤液
1、 EPBS/Tween—20
EPBS+0.05%Tween—20（或80）
2、 Tris—HCL/Tween    PH7.4    0.02M
1.0M       Tris          20ml
1.0N          HCL       15ml
1.0N          HCL       15ml          调PH至7.4
Tween—2.0             0.5ml
DW          加至于1000ml
   四、底物溶液
1、磷酸盐—柠檬酸绶冲液（NO.1）
0.1M 柠檬酸:10.5g C6H6O7.H2O+DDW500ml
0.2M Na2HPO4.12H2O+DDW1000ml
取24.3ml0.1M柠檬酸、25、7ml0.2M  NaHPO4再加50mlDDW
注:柠檬酸溶液及配成的底物绶冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。
2、 OPD（邻苯二胺）底物
NO.1底物绶冲液       10ml
OPD                            4mg
3%H2O2                      40ul
3、 TMBS（四甲联苯胺硫酸盐）
TMBS贮液：10mg/ml    DMSO    4℃避光存放。
TMBS贮液    100ul
NO.1底物绶冲液       10ml
1%H2O2                      25ul
      4、0.05M PH  7.6 Tris_—HCL缓冲液
            0.1M       Tris                   50ml
            0.1N       HCL                38.5ml
            DW至100ml
      5、TBS    buffer       （NO.2
            20 Mm          Trisbase
            500Mm          NacL
            adjusted to       PH7.5    With    HCL
6、 DAB（二氧基苯胺盐酸）底物
DAB       75mg
NO.2底物绶冲液100ml
避光搅拌3小时,使其溶解,滤纸过滤.临用前加1%H2O2  0.5ml
      7、4—氯—1—萘酚底物（4CN）
            (1) 4CN贮液：3mg    4CN溶于是ml甲醇中，4℃保存；
         (2) 使用液：2ml  4CN贮液+10mlTS buffer+H2O2至0.01%(V/V)
7、酶反应终止液
2m H2SO4
浓H2SO4    10ml溶于80ml  DW
六、内源酶灭活液：
      0.01%H2O2,NaN,PH7.6 0.05M  Tris—HCL绶冲液：
      取PH7.5 0.05M  Tris—HCL绶冲液98ml，加1%H2O21ml  1% NaN 1ml即成。
第八节酶标抗体的制备
一、 1、          试剂
1、 0.1M NaHCO3：0.84gNaHCO3+DDW  100ml
2、 0.1M Na2CO3：1.06g Na2CO3-DDW 100ml
3、 EPBS：同第七节
4、 10mM NaIO4  204.0mg NaIO4+DDW 100ml
5、 0.1mM NaOH
6、 5mg/ml NaBH4：0.1g NaBH4+0.1mM NaOH  20ml
二、 HRP直接标记腹水中单抗
1、 5mg HRP溶于0.5ml 0.1M NaHCO3
2、加0.5ml 10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞
3、室温（20℃）避光作用2h
4、加0.75ml 0.1M NaCO3，混匀
5、加0.75ml小鼠腹水，混匀
6、用少许PBS将交联物转移到一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中
7、加Sephadex G15或50干粉0.5g，混匀。盖紧，室温作用（避光）3h
8、用少许PBS将交联物全部洗出
9、收集洗出液，加1/20V新鲜配置的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟
10、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h或4℃过夜
11、将交联物过Sephdex G200或Sepharose 6B（2.5*50cm）层析纯化，分管收集第一峰
12、酶结合物质量鉴定：
（1）克分子比值测定
酶量（mg/ml）=OD403*0.4
Ig量（mg/ml）=（OD280-OD403*0.3）*0.62
酶结合物克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量
标记率=OD403/OD280
E/P值为1-2之间合格
（2）特异性及效价测定：应用ELISA同时确定酶结合物的特异性，酶活力，抗体活性及效价。
将酶结合物对倍稀释后平行加于阴性孔及阳性孔，合适底物显色后记录各个稀释度的特异及非特异显色值，绘制特异及非特异反应曲线，比较二条曲线可以确定其特异性，酶活力及抗体活性。特异显色为1.0时的稀释倍数，一般可作为交联物的效价。实际使用浓度应适当升高2-5倍。
13、酶标记抗体的保存：加等量甘油（A.R）后，-20℃存放。
三、 HRP标记提纯抗体制剂：（纯化抗体请参见有关章节）
（一） HRP 的活化
1、 5mg HRP（RZ>3.0）溶于0.5ml新配制的0.1M NaHCO3试管中；
2、在上述溶液中加入0.5ml 10mM NaIO4，试管加塞塞紧，20℃暗处放置2h
3、加0.1ml 0.1M Na2CO3以减慢氧化
（二）标记
1、用0.1M Na2CO3（Ph9.2）（1-2ml）配制15mg Ig溶液
2、将Ig溶液加入HRP溶液（HRP：IgG分子比为1：2）
3、立即将IgG-HRP混合液移入5ml注射器外筒（下口塞有玻璃棉，并接上橡皮帽），加入混合液重量的1/6  Sephadex G25或50干粉；室温3h或4℃过夜
（三）稳定化
1、用少许PBS洗脱酶标记物
加入1/20V的NaBH4酶标记物中；室温作用30分钟，加入3/20V的NaBH4，室温作用1h（可与4℃过夜）
（四）提纯同前。
（五）酶结合物质量鉴定及保存，同前。
成功范例：酶标记大肠埃希氏菌粘附素单抗，沙门氏菌O、H抗原单抗，NDV单抗，羊抗鼠Ig抗体等。

第五章免疫荧光试验程序
第一节间接免疫荧光试验
一、抗原制备
1、固定细胞片的制备：
生长在盖片上的细胞（接种或未接种病毒），可直接收获盖片，在PBS中洗涤，用4℃100%丙酮固定2分钟，空气干燥，置密封容器于—20℃保存备用；单元细胞悬液可在盖片上制成涂片，固定方法同上。
2、单细胞悬液制备：
用含0.1—1%BSA和0.1%的叠氮钠的PBS洗2—3次。注意所有各步需在4℃进行！经细胞计数，调节细胞浓度至10（7）/ml，可供作活细胞的膜荧光染色。
3、细菌涂片的制备：
将10ul细菌悬液（1X10（6）个/ml）涂沫7X21mm盖玻上，自然干燥后，用—20℃丙酮固定10—15分钟，于—20℃保存备用。
4、病变组织触片的制备，按常规方法。
5、病变组织冰冻切片的制备。
二、抗体染色及结果观察
1、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10—20ul杂交瘤上清或其它待检样品，设立阳性、阴性对照。
2、 37℃水浴孵育0.5—1h。
3、盖片在PBS（PH7.4,0.01M）中用磁力搅拌器洗涤15分钟.
4、取出盖片置架上,滴加工作浓度己测定的荧光第二抗体.
5、 37℃孵育0.5—1h。
6、洗涤15分钟。
7、取出盖片，用延缓荧光猝灭的封载剂封存于干革命净玻片上。
8、在荧光显微镜下观察：
阳性结果：可在细胞浆，或细菌外周，或细菌粘附素鞭毛等可见特异性荧光（FITC为黄绿色荧光）。
成功范例：粘附素单抗检验，O抗原单抗检验、NDV单抗检验、NDV诊断等。
附一：活细胞的膜荧光染色
1、在小试管中加入100ul单细胞悬液后，再加100ul第一抗体，并混匀。在冰浴上孵育30—60分钟。
2、将细胞重新悬殊浮1—5ml洗涤剂中，以400g离心5分钟洗涤，重复一次。
3、以100ul洗涤剂悬浮，加工厂100ul荧光抗体，置冰浴30—90分钟。
4、洗涤2次
5、将细胞重新悬浮于20—30ul含水量10% 甘油，10—100ug苯二胺（）ml的洗液中（PH7.0左右）滴于载玻片上,加盖玻片封载.
6、立即在显微镜下检查,细胞亦可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定,立即检查,或至少在4℃可保存一周.
成功范例:NDV单抗膜荧光染色
      附二:
1、双重染色:标本中有两种不同抗原,可用FITS和RB200,分别标记两种抗体,同时或先后反两种荧光抗体进行染.                   2、反衬染色：对于组织标本，为了加强特异性荧光的鲜明性，常需使用反          衬染色。最常用者为伊文氏蓝（1：10000—1：100000），它发射红色荧光，可反衬出FITC的黄绿色荧光。
附三：
1、 PH7.4  0.1M磷酸缓冲液
      Na2HPO4.12H2O             28.94g
      KHPO4                               2.6g
         DW                                  1000ml
应用时取上述贮存液100ml,加入NaCL8.5g,加DW至1000ml,即为PH7.4  0.01M  PBS.
                     2、缓冲甘油
                     SoL.Ι
                              甘油(A.R.)          9份
                                 PBS                   1份
                     SoL Ⅱ
                                 甘氨酸             0.42g
                                 NaOH                0.021g
                                 NaCL                0.51g
                                 NaN                   0.03g
                                 D.W.                   至30ml
                                 加入                   70ml
第二节直接免疫荧光试验
1、抗原制备同前
2、加染荧光素标记的特异抗体。
3、 37℃温育30—60分钟。
4、洗涤15分钟。
5、取出盖片，完全干燥后，用封片油封于干净的勒玻片上。
6、镜检
成功范例：沙门氏菌快速检验，NDV诊断。
第三节荧光抗体的制备
一、试剂
1、 PH9.3碳酸盐缓冲液
无水Na2CO3    8.6g
NaHCO3             17.3g
D.D.W                1000ml
2、 PBS（PH7.4，0.01N）同前
3、二甲基亚砜
二、标定程序
1、以碳酸盐缓冲液调整蛋白浓度至10mg/ml；（腹水单抗可直接用碳酸盐缓冲液稀释；提纯的抗体IgG，需经SephadexG25柱层析或透析方法转换缓冲体系至碳酸盐缓冲液）。
2、取代5ml抗体溶液于10ml小烧杯内，磁棒轻搅。
3、称取1mlFITC溶解于0.2mlDMS中。
4、待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内。
5、 20℃闭光作用2h，可不搅拌。
6、将交联反应后的溶液经SephadexG25或G50柱析层除去游离的荧光素。
7、收集第一峰为标记的抗体。
三、FITC结合物质量鉴定
1、测定F/P比值：
                                 OD100-0.35XOD495
[IgG]（mg/ml）=——————
                              1.4X
F/P=2.87
抗IgG荧光抗体F/P比不宜高于1---2；抗细菌荧光抗体F/P可允许高于2，乃至高标记（F/P10——15）。
2、特异性及效价测定
以标记抗体染色各种抗原的盖片，同时测定其特异染色滴度和非特异染色滴定，并观察抗体活性。
         四、标记抗体的保存
            标记抗体宜保存于4℃；
            或加50%甘油（A.R），-20℃冻存。
            成功范例：沙门氏菌O抗原单抗标记，羊抗鸡IgG的标记抗体的制备等。

第六章间接血凝试验的程序
第一节脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备
一、甲醛化绵羊红血球制备：
（一）醛化血球试剂：
1、PH7.2 PBS
         NaHPO4.12H2O             3.5816g
         KH2PO4                            0.4082g
         NaCl                                     8.014g
      D.W.                                     1000ml
3、双倍离子强度的PH7.2PBS
Na2HPO4.12H2O                         0.3581g
KH2PO4                                     40.82g
NaCl                                              0.814g
D.W.                                                 50ml
4、抗凝保存液（即Alsever氏液）
枸椽酸钠                   0.8g
枸椽酸辣                      0.055g
氯化钠                         0.42g
葡萄糖                         2.05g
D.W.                               1000ml
5、甲醛（A.R.或C.P.）:临用前用双倍离子强度的PBS作对稀释,配成20%的甲醛。
6、饱和硫酸铵溶液：按25℃饱和溶解度配制。
               （二）、步骤：
1、无菌采集绵羊颈静脉血50ml，用要枸椽酸钠作抗凝剂；
2、用5倍于红细胞压积的PH7.2PBS充分洗涤5次,每次1500rpm5___10分钟,直至上清测定无蛋白质(用饱和硫酸铵滴定上清,观察有无白色沉淀),再以相同缓冲液配制成25%SRBC悬液;
3、 25%SRBC与20%甲醛以25:1的比例混匀,37℃水浴作用2小时;每15分钟振荡一次,红细胞颜色由红色转变为棕色;
4、取出,以PH7.2PBS洗涤4次,每次2000rpm10分钟,再加同样的PBS,制成25%SRPB;
5、重复第三步醛化一次,同法洗涤;
6、最后配制相当于20%醛化SRBC悬液,并加入侵.3%甲醛(最终浓度)或者0.01%硫柳汞防腐,分装,4℃保存备用.
二\脂多糖抗原制备___热酚水法
1、菌泥悬浮于100ml水中，或20g菌粉悬于350ml水中；
2、将新配的90%（V/V）苯酚（最好是新蒸的）预热至68℃—70℃；
3、加酚液于菌液中，至酚的最终浓度为45%，68℃水浴作用25分钟，并充分振荡；
4、冷却至10℃左右，12000rpm30分钟，离心管内分层情况依次是：水层、蛋白质层、酚层和沉淀物。
5、小心吸取上清，（准备透析袋）
6、余下部分再加水80ml，68—70℃水浴维持30分钟，冷却至0℃左右，离心吸水层；
7、将水层提取物装入透析袋，流水透析1天，蒸馏水透析2天；
8、收集粗品LPS，冻存备用。
   三、蒽酮比色定糖法—测定粗制LPS的多糖含量。
1、原理：蒽酮可以和游离的或多糖中存在的己糖果，醛戊糖及己糖果醛酸起反应，反应后溶液显蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
2、试剂：
（1） 2g/L蒽酮试剂：溶解2克蒽酮于浓硫酸（A.R. d=1.84,95%）,宜当日配制使用.
（2） 0.1g/L葡萄糖溶液或0.1g/L糖元溶液.
      3、实验步骤
（1）标准曲线制备

管号                            1          2             3             4             5             6                7             备注

标准葡萄糖液       0.05          0.10       0.20       0.30       0.40       0.60             0.80    置水浴中
蒸馏水                   0.95          0.90       0.80       0.70       0.60       0.40             0.20    置水浴中
蒽酮试剂                3.0             3.0          3.0          3.0          3.0          3.0                3.0
沸水浴             蒽酮加入后，将试管移入沸水浴，煮沸10分钟，冷却至室温
测定OD820值
含糖量                   5                10          15          20          25          30                35
绘制标准曲线：以OD820为纵坐标，糖含量（ug/ml）横坐标绘制标准曲线。
或以统计方法，求出糖含量与OD820之间的相关系数，及直线回归方程。
（2）样品含糖量测定：
   取1ml稀释的粗制LPS，加速度。3.00蒽酮试剂,混匀后迅速置于冰浴冷却.然后转入沸水浴中煮沸10分钟表（与制备标准曲线同时进行）。冷却至室温后，测定OD820，从标准曲线中查找相应糖含量，或代入回方法求得糖果含量。
四、脂多糖抗原致敏甲醛化SRBC
1、取粗制LPS，加0.2M  PH8.0  PB液,调整多糖浓度至120ug/ml,100℃水浴 1小时.
2、冷却至少37℃;
3、配制6%醛化SRBC溶液;
4、将热处理LPS与醛化SRBC等量混合,37℃搅拌作用45分钟;
5、取出离心2000rpm10分钟,以0.01M PH7.2PBS洗澡4次;
6、配制4%致敏血球,分装,保存于4℃备用.
7、致敏血球质量鉴定:
（1）自凝性测定：血球制备过程中，洗涤不彻底，或过度化等，都可引起血球的自凝。
（2）特异性测定：与不同抗体试剂反应，确定其反应特性。
（3）工作浓度测定：选择最佳最省的致敏SRBCIPYA。
附0.2MPH8.0PB溶液.
基础液A       0.2Mna2HPO4
               Na2HPO4.2H2O(MW353.22)    35.61g
               或  Na2HPO4.12H2O(MW352.22)  71.6g
               DW                         1000ml
基础液B       0.2M  NaH2PO4
               NaH2PO4.H2O(MW138.01)       27.6g
               或NaH2PO4.2H2O(MW156.03)    31.21g
               DW                         1000ml
使用液:       A液94.7ml  +B液5.3ml
成功范例:沙门氏菌脂多糖抗原敏化SRBC制备,及其在单抗检测、鸡白痢等检疫中的应用。
第二节蛋白质敏化SRBC的制备
一、双醛化红细胞制备
1、采绵羊抗凝血；
2、用10倍于红细胞压积的0.11MPBS(PH7.2)洗4—6遍；
3、用同一PB配成8%SRBC；
4、配制醛化试剂：
   丙酮醛       3ml
   甲醛          6ml
   0.11MPB液(PH7.2)    94ml
5、将醛化试剂缓慢加入等到量的8%SRBC中；
6、室温（20℃）缓慢搅拌17小时；
7、 PB洗三次；
8、配成20%双醛化SRBC，加0.1%NaN2防腐,4℃保存备用.
附:醛化红细胞的鞣酸处理亦能吸附蛋白,但其敏感性很低;经鞣酸化后,红细胞吸附蛋白质的量显著增加,但同时加强了红细胞的不稳定性,(请根据要求确定是否要鞣酸化).,容易自凝,但增强了反应的敏感度.可用1%正常免疫血清稳定之.
1、将醛化红细胞配成2.5%悬液;
2、加入新鲜配制1:10000稀释的鞣酸溶液 ;
3、混匀后置37℃水浴15分钟;
4、洗涤后再配成品2.5%悬液.
二、抗原致敏
1、取20%双醛人红细胞 01ml,1500g离心弃上清
2、 ;沉积红细胞加0.2M  PH4.醋酸—醋酸钠缓冲液1ml，并加最适浓度（预先要测定，蛋白抗原为50ug/ml左右）的抗原1ml
3、混匀，于45℃致敏35分钟，不时轻轻摇动使红细胞不下沉；
4、离心弃上清，并用20倍红细胞压积的PB 洗4次；
5、配成1%致敏血球，4℃冰箱保存备用。
成功范例：粘附素致敏感SRBC。
第三节 PHA试验程序
1、 V型微量血凝板上每孔加入PH7.2PBS稀释液25ul(一滴),一个样品做一排;
2、加入25ul杂交瘤培养上清液或其它待检血清,依次作倍比稀释;同时设立阴性,阳性对照;
3、再加入0.5—4%致敏血球1滴；
4、将血凝板在振荡器上，振荡30秒；
5、置室温半小时观察结果。
第七章免疫胶体金试验程序
1、取样：铜网沾取细菌悬液（80亿/ml）；
2、漂洗：PH7.4  0.05M  TBS,三次,每次5分钟;
3、第一抗体(单抗)反应:与一定稀释度的抗体应,37℃半小时;
4、 PH7.4  0.05M  TBS漂洗
5、 ;与兔抗鼠IgG37℃作用半小时;
6、先PH7.4  0.05M  TBS漂洗三次,每次分别再用PH8.2  0.02M  TBS漂洗三次,每次5分钟
7、 ;与羊抗兔胶体金(陕西省中医药研究院)（1：10）稀释液作用，4℃过夜，（或用SPA胶体金，宁军区医院）；
8、先用PH8.2  0.02M  TBS漂洗三联单次,每次5分钟,再用PH7.4  0.05 TBS 漂洗,每次5分钟;
9、晾干后电镜观察.
成功范例:大肠埃希氏菌粘附抗原定位,沙门氏菌O抗原、H 抗原定位。
附：
一、负染色：常规电镜负染色法，细菌悬液浓度8亿/ml，1%PTA染色30秒钟。或铜网经0.02%GA室温处理30分钟,然后吸干,滴加培养菌液或提取抗原,用1%磷钨酸染30秒,晾干后电镜观察.
二、免疫酶染色：
1、同前
2、同前
3、同前
4、与羊抗BALB/C小鼠IgG酶标抗体作用，37℃半小时，经PH7.4  0.05M  TBS漂洗后,与底物溶液作用5—10分钟，漂洗，晾干后电镜观察。
附：1、底物溶液：PH7.6  0.05M  Tris—HCL缓冲液
0.125%  DAB
0.03% H2O2
3、 1%BSA：以PH7.4  0.05M  TBS配制

第八章免疫球蛋白亚类测定的程序
第一节免疫扩散法
单抗类和亚类鉴定的常用方法
一、试剂
1、0.06M巴比妥钠—盐酸缓冲液    PH8.6
  （1）  0.06M巴比妥钠(MW 206.18)    1.237g
      D.W                            100ml
(2) 0.2N盐酸溶液
浓盐酸                         1.68ml
DW                         至100ml
(3) 0.06M巴比妥钠—盐酸缓中液PH8.6  取(1)液化气100.00ML,用力.2N盐酸溶液调节PH至8.6(大约用4.00ml)
2、1%agarose
   agarose（B.R.）    0.8g
0. 06M巴比妥钠盐酸缓冲液80.0ml
隔水煮沸溶化.
5、羊抗小鼠IgG亚类血清
   IgM， IgG，IgG32，IgG24，IgG2
二、方法
1、浇琼脂糖板，每片约3ml；
2、琼脂糖板打孔（孔径为1—2mm，孔间距离3—5mm），挑出孔内琼脂后，补孔；
3、向中央孔注入抗Ig亚类抗血清，周围孔加入待测样品（1：20稀释腹水样品，或20倍浓缩的培养上清），每孔2—3ml；
4、置湿盒内室温下扩散或4℃过夜观察沉淀线，判定结果。
附：（1）20倍浓缩的杂交瘤培养上清的制备。最简单方法是将20ml培养上清倒入一平皿，电扇砍风蒸发浓缩至于ml，或装过透析袋，用PEG6000或蔗糖吸水；
或以浓缩胶吸收上清中水份。
单克隆浓缩抗体是上清中在的叭一的小鼠Ig，因此，浓缩培养上清是鉴定Ig类和亚类的最好材料。
（2）20倍稀释的杂交瘤腹水
因为腹水中含有小鼠正常Ig，所以用腹水（或血清）鉴定单抗类和亚类，可能会得到模棱两可的结果，在大多数情况下腹水经过1：20稀释后，其中的正常Ig浓度变得很低，不易被免疫力扩散测出。
第二节 ELIST法
1、用EPBA稀释山羊抗菌素小鼠Ig至工作浓度；酶标板每孔加入100ul，37℃孵育2小时。
2、用PBST洗涤3次。
3、每孔加200ul 1%BSA EPBS  37℃1小时。
4、 PBST 洗涤2次。
5、加100ul杂交瘤上清液，37℃2小时，或4℃过夜。设立阴阳对照。
6、 PBST洗4次
7、分别加入100UL多种兔抗小鼠Ig亚类特异血清，每种至少重复（）孔，37℃2小时。
8、 PBST洗4次
9、加100ul HRP标记的羊抗兔Ig，37℃2小时。
10、 PBST洗4次。
11、每孔100ul OPD底物显色，室温作用15分钟，2M浓H2SO4终止反应。
12、肉眼观察结果，或测OD490值判定结果。
第九章免疫血清的制备
第一节免疫球蛋白提取与纯化
一、试剂
1、饱和硫酸铵：500g(NH)2SO4(A.R.)加入500ml  D.W.中，加热至完全溶解，室温过夜，临用前用2N  NaOH调pH至7.8。
2、 32%硫酸钠溶液：72.6g  NaSO4.10H2O 溶于60-80ml D.W.中，定容至100ml
3、 16%硫酸钠溶液：50ml32%硫酸钠溶液加于50mlD.W.，混匀。
4、 2N NaCl
5、 2N NaOH:16gNaOH+200mlD.W.
6、 0.5NnaOH:20gNaOH+1000mlD.W.
7、 2%NaHCO3(煮透析袋用):8gNaHCO3+400mlD.W.
8、 PBS  (10mMNaH2PO4_Na2HPO4,10mMNaCl PH6.8):
Na2HPO4.12H2O       17.55g
NaH2PO4.2H2O       7.96g
NaCl                   5.84g
D.W.                   10000ml
9、0.5M氯化钡溶液(检测SO42-)氏试剂
10、萘氏试剂（Nesslers  reagent）：
碘化汞    115g
碘化钾    80g
  D．D．W．（不含氨）500ml    待溶解后，过滤，滤液中加入20%NaOH500ml。
  测定时，取样品3—4ml，加入上述萘氏试剂1—2滴，若有铵离子存在，则出现砖红色反应，甚至可发生棕色沉淀。
二、免疫球蛋白（IgG）粗提
所得粗制Ig，可以作为免疫原，可用作标记抗体制备。
(一) 硫酸铵沉淀法
适用于鼠、兔、猪、羊、鸡等血清或抗血清和小鼠单搞腹水中Ig的提取。此方法为盐析法提取Ig的首选方法。
1、取10ml血清、抗血清或胜地水，10000rpm15分钟，去除细胞碎片及其它颗粒物质。
2、将上清转移于小烧杯中，其内置磁棒，于磁力搅拌器上轻搅拌。
3、滴加饱和硫酸铵（PH7.8）5.0ml,加时应缓慢,每加一滴后应待混匀后再加下一滴.
4、继续轻轻缓慢搅30分钟,注意避免产生气泡.
5、 10000rpm15分钟.
6、弃去上清液,沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮,10000rpm15分钟
7、 .重复步骤6二次
8、 .最后一次洗澡后的沉淀溶于1.5mlPBS中.
9、于透析袋内过夜透析(4℃).其间换液3—5次，直至检查不到NH4（）和SO4（）。
10、移出蛋白质溶液，1000rpm15分钟，收存上清液即为粗提免疫球蛋白。
   或将蛋白质溶液经SephadeX  G25  或G50层析过程，均以PBS作平衡液和洗脱液。
11、收集第一峰，测定蛋白质含量（mg/ml）。
   [Pr]=（1.45XOD280—OD290X0.74）X稀释倍数
         OD280
   或[Pr]=——————X稀释倍数
         1.3
  或[Pr]=1.5(OD280—0.5XOD290)X稀释倍数
12、小量分装后，4℃可长期保存，亦可—20℃冻存或冻干保存。
13、提纯的Ig保存要求PH中性，盐浓度过100—200Um，蛋白质1—10mg/ml，加防腐剂。此外，使用或分离Ig的温度最好是2—4℃。特别是鸡、小鼠、大鼠等要比其次动物Ig更不稳定，因此，在处理这类Ig时特别当心。
（二、）硫酸钠沉淀法
   适用于兔和鸡血清中的Ig提取，但该不稳定。
1、2、同前
3、滴加速度32%Na2SO4溶液10ml，滴加时应慢，每加1滴后待混匀后再加下一滴。
4、继续缓慢搅拌30分钟。
5、 10000rpm15分钟。
6、弃去上清液，沉淀物用16%Na2SO4悬浮，10000rpm15分钟。
7、重复步骤6二次。
8、以下步骤同前。
附一、不同动物血清球蛋白硫酸铵盐析浓度参考值
血清来源
         硫酸铵饱和度（%）
家兔
山羊
绵羊
小鼠
大鼠
鸡
马
猪


      33X3次
      30X1，33X2
      33X3
      33X1，40X2
      35X1，40X2
      33X3
      30X1，45X1
      33X3
      30X1，45X1

      33X3
附二透析袋处理
1、透析袋于2%NaHCO3+1Mm  EDTA  中煮10分钟。
2、用蒸馏水洗透析袋子内、外表面。
3、再用蒸馏水煮10分钟。
4、冷至室温即可使用。如暂时不用则将透析袋浸于0.2MEDTA溶液中，4℃存放。
5、使用后的透析袋用 DW反复部洗后，同上法处理，浸于0.2M EDTA溶液，4℃存放。
6、注意事项：
（1）透析袋亦可高压灭菌消毒。
（2）吸取或装入透析物时，手指不能直接接触透析袋，应戴一次性手套或使用镊子。
（3）透析袋用应及时洗涤、处理，以便重复使用。注意节约。
三、免疫球蛋白的纯化
（一）离子交换柱的制备
1、 20g DEAE---纤维素(whatman  DE  32)浸泡于200ml 0.5NHCL,0.5小时，中间搅动两次。
2、用蒸馏水反复抽洗，直至PH接近D.W.的PH值。
3、用200ML 0.5N NaOH浸泡15分钟，中间搅动两次。
4、抽去液体。
5、将湿胶再用功200ml 0.5NaOH悬浮，浸泡15分钟，然后抽去液体。
6、重复步骤5
7、将湿胶再用D.W.反复抽洗，直至抽出液PH值接近D.W.的PH值。
8、再用起始缓冲液反复冲洗，直至抽出液的PH值勤和导电值与起始缓冲相同。
9、在装柱前，去除微细颗粒。柱底填一些玻璃棉，上面再放置一层Washed sand或glass beads以防cellulose流出柱。
10、用缓冲液淋洗，使柱床稳定（2.0 ×30cm）流速1---3 ml/分钟或20滴/分钟。
（二）纯化免疫球蛋白
1、将脱盐后的粗蛋白对离子交换柱加样。注意每克DRAE---纤维素能受的蛋白质为了30—50g。
2、梯度洗脱（0---300M NaCL）,用自动部分收集器分管收集，每管5ml。起始液为PBS(0.01M PB,0.01M NaCL,PH6.8)或(0.01M Tris—HCL PH6.8)。
3、测定蛋白测量，分装-20℃冻存
4、此法提取的主要是IgG ,但可能会混有β-球蛋白。每毫升血清或腹水可提得Ig3-10mg
5、若需进一步提纯，可过Sephacryls-300柱层析
(86-123)缺
（三）凝胶再生的方法
1、洗脱出第一蜂后，用2N  NaCL淋洗至基线稳定，再用起始缓冲液抽洗至洗出液的电导值与缓冲液相同，重新装柱使用。
2、如再生胶暂不使用，应加防腐剂，置4℃保存，下次装柱应抽洗去除防腐剂。
成功范例：羊抗鼠IgG，各种单抗、猪、鸡、小鼠等血清中IgG。
四、亲和层析一步法提纯IgG
1、每5ml湿胶（1.5g干粉）可以经合100—125mg  IgG。
2、血清或腹水或杂交瘤培养上清加样后，以PBS充分洗涤，至记录仪基线稳定。
注意：直接使用腹水，可能会因纤维蛋白而阻断亲和力。
3、以0.1N甘氨酸—HC L，PH2.5作为洗脱液,注意在PH2.5不稳定的抗体,应考虑用较高PH 进行洗脱.
4、迅速以1M  Tris—HCL  PH8.0中和洗脱的提纯Ig(亦可透析中和).柱再生.
5、以下步骤同前.
成功范例:提纯兔抗鼠IgG。
附一、不同IgG亚类与SPA结合与洗脱的条件
IgG亚类

来源
结合
洗脱
IgG1
IgG24
IgG24
IgG9
小鼠
小鼠
小鼠
小鼠 PH>8.0
PH>7.0
PH>7.0
PH>7.0 PH<6.0
PH<4.5
PH<3.5
PH<4.5
   附二、SPA与免疫球蛋白的结合活性

免疫球蛋白

SPA
免疫球蛋白
SPA
小鼠IgG1
IgG24
IgG24
IgG6
IgM
IgA
IgE
兔IgG
鸡IgG
+（—）
+
+
—
—
—
—
+
— 山羊IgG1
   IgG2
绵羊IgG1
   IgG2
猪IgG
猫IgG
豚鼠IgG
—
+（—）
—
+
+
+
+
—
（二）羊抗鼠Ig交联Sepharose  4B以提纯小鼠Ig
注意：溴化氰易挥发，如果吸入或通过皮肤吸收有巨毒，所有接触CNBr设备应浸在NaOH中，在通风橱里过夜，然后将氰化物洗掉。
1、以1升水用真空抽滤的方法Sepharose  4B（10ml沉淀体积），去除防腐剂（不要完全抽干），重悬于水中，总体积为18ml，置于50ml的烧杯中。
2、加入2ml碳酸盐冲液（0.5M碳酸钠PH10.5）和磁力搅拌子,在通风橱中搅拌,将PH 电极置于悬液中,检查搅拌器和PH计的工作情况.
3、戴好手套,小心将1.5克CNBr(避免大颗粒)倒入小瓶中。（在通风橱中完成这项工作是安全的，先称小瓶和瓶盖子的重量，然后在通风橱中往小瓶中加CNBr，小心盖紧盖子，移出通风橱称重，原来装CNBr的瓶子的药勺留在通风橱中）。
4、缓慢的搅拌Sepharose悬液，监测PH并加入固体CNBr（将药勺和空小瓶置于1M  NaOH中），逐滴加入4M的NaOH 以保持PH在0.5—11.0,直至固体CNBr全部溶解以及PH降低的速度减慢(10—15分钟)。
在此过程中如果PH高于11.5,则弃去Sepharose,重做.
5、用烧结玻璃或布氏漏斗过滤混合物，用2升冷柠檬盐缓冲液（0.1M PH6.5柠檬酸钠,预冷却至4℃）迅速洗涤Sepharose(不要完全干),小心处理过滤器(含CNBr).
6、快速将活化的Sepharose加到IgG溶液（100mg溶于10ml柠檬酸缓冲液中置于
4℃）中，置于转动混匀器上，使之不断的轻轻混匀，4℃
过夜。如果没有转动混匀器，则轻轻搅拌混合物1小时，然后静置过夜）。
7加1ml乙醇铵溶液，继续轻轻搅拌1小时，以确保安全去除活性基因。
8让Sepharose自然沉降，上清用500g离心5分钟，在280nm测上清液吸光度，计算未偶联到Sepharose上的IgG百分率。假设上清液的总体积为11ml（蛋白溶液+乙醇胺）加5ml（10ml  Sepharose的内部液体体积）。IgG未偶联率小于10%，通常为1—5%。
9、将IgG—Sepharose  装于合适的柱（可将多孔圆盘放在注射针筒骨来制造一个简单的柱）中，用PBS洗涤，柱中加入含0.1%叠氮钠的PBS,4℃
保存.
      10分离提纯Ig同前述可参阅有关资料。IgG—Sepharose有时要用同类动物正常Ig封闭之。
      成功范例：提纯培养上清中的单抗。
第二节几种常用抗原的制备
一、脂多糖抗原制备
（一）粗制LPS制备，参见第六章
（二）精制LPS制备
1、粗制LPS经3倍95%酒精，37℃水浴作用15分钟；离心后，沉淀物以蒸馏水配成3%溶液。
2、超速离心100000Xg  4小时。上层为上清液，中间层为沉淀的LPS胶体，下层为粘液样沉淀物。
3、吸弃上清，小心取出沉淀物的LPS胶体（中间层）。
4、将LPS溶解在原体积的1/2蒸馏水中，再离心一次。
5、沉淀的LPS溶液于少量DW中，冻干保存。
超离后分层情况
（三）多糖抗原制备：
1、将LPS 200mg溶解在20ml  1%醋酸溶液中，以移入带塞的试管中。
2、  100℃水浴30分钟。
3、 5000Xg离心沉淀类脂，吸取上部液体，装入透析袋中，4 ℃透析48小时。
4、冻干提取的多糖，产量为LPS的30——、40%。
   成功范例：沙门氏菌A—F群LPS提取。
二沙门氏菌鞭毛抗原的制备
  1、将半固体培养基筛选活泼动力的单相沙门氏菌血清型接种到10mlM肉汤中，37℃
16小时。
2、再移种到500ml  M肉汤中，37℃16小时。
3、 400ur/m离心30分钟，收集细菌。
4、以适量生理盐水悬浮菌泥，并用1N盐酸调至PH7.0,室温轻度振荡30分钟.
5、 1000r/m 30分钟.上清中含有大量脱落下来的鞭毛素.
6、以1NnaOH将上清调至PH7.2.
缓慢加入饱和硫酸铵溶液,边加边搅拌,达67%饱和硫酸铵浓度后,4℃过夜.
   8次日将上清以15000r/m4℃离心20分钟。
9、将沉淀物溶解于2ml蒸馏水中。
10、过Sephacryl  S300层析柱（2.0X50cm）,用Tris—HCL缓冲液洗脱，流速20ml/小时，收集第一峰，测定蛋白质浓度，分装保存。若对提纯要求不高，可以省略此步。
11、提纯鞭毛素的质量鉴定
（1） SDS—PAGE：在非降解和降解条件下于10%凝胶SDS——PAGE垂直板上电泳（KB—2301电泳仪），恒流，25Ma/板，10℃电泳5小时。
（2）凝胶用三氯醋酸溶液固定过夜色。用考马斯亮兰G—250染色。
（3）计算蛋白带分子量：Ha  50000，Hb 53000，Hd46000。
  12提纯鞭毛素的等电点测定—IEF
（1）取60ul样品溶解在9M脲和1%2—巯基乙醇中。
（2）上样于含有2%Ampholin（PH3.5—9.5）（LKB  Bromma，Sweden）和6M脲的4%聚丙烯酰胺凝胶（用22.2%聚丙烯酰胺和1.4%  双甲丙叉烯酰胺原液配制）。
（3）蛋白质在LKB  1117—003多功能电泳仪上，恒流4mA待电聚焦至电压250—300V。
（4）电泳5小时后，用10%三氯醋酸固定凝胶，经40%乙醇洗涤后，用0.1%考马斯亮兰G250染色过夜,再用14%醋酸脱色.
（5）确定PH梯度凝胶，从阳极端切成0.5cm长度,分别装入小试管内,加去离子水1小时后,用酸度计或PH试纸测PH值,划出PH梯度斜线,并确定样品的等电点.(Ha5.1,Hb5.1  Hd4.9)。
三、粘附素抗原的制备
（一） K88、K99和K987p的制备
1、将G—7或E68、C83907和UP001在37℃培养16—20小时。
2、从克氏瓶中洗下，用0.1M PBS(PH7.0)悬浮。
3、 62℃水浴振荡20分钟使粘附素脱落。
4、 8000r/m20分钟，其上清液用10%乙酸调PH至4.5，4℃放置过夜，使K88粘附素沉淀（等电点沉淀）。
5、以8000r/m离心，将沉淀物用0.1M  PBS溶解。
6、经Sephadex G200柱层析（2.6X80cm）纯化，用0.01M  PBS(PH7.0)作为平衡液及洗脱液,流速为1ml/分.
7、收集第1峰,合并前半峰即为纯化K88抗原.。
8、测定蛋白质浓度，小量分装，—30℃保存备用。
（二） K99抗原的制备
1、 K994529在Minca培养基上37℃培养18小时。
2、磷酸盐尿素缓冲液洗下菌细胞。
3、 60℃加热孵化20分钟，离心后去菌体，上清加60%饱和硫铵，4℃搅拌2小时。
4、离心收集沉淀，悬浮沉淀对上述缓冲液透析16小时。
5、进一步经Sephadex  CL—4B柱层析纯化，浓缩后再经SephadexG—50脱盐。
（三） 987P抗原的制备
1、 C88710 Slane培养基37℃20小时培养。
2、生理盐水洗下菌笞，离心收集菌体。
3、菌泥中加入400ml含2M尿素0.01M PBS，60——63℃ 1—1.2小时。
4、 60%饱和度硫酸铵沉淀离心上清。
5、离心后，沉淀物再过Sepharose  4B柱。
6、收集第一峰前半峰，浓缩后经Sephadex  G50脱盐。
（四） F48抗原的制备
1、 C95707、C85919和B41M分别接种Minca培养基上，37℃18小时。
2、灭菌0.05M  PH7.2 PB收集菌体。
3、 62℃水浴加热处理1小时，并不时振动，离心去菌体。
4、上清置4℃72小时，等电点4.6沉淀法使粘附素沉淀 .
5、离心后,将沉淀于Separose  CL—4B纯化，以含2M尿素0.05M PH7.2 PBS洗脱,洗脱液浓缩后再脱盐。
附：各种粘附素等电点。
   K88       4.2
   K99       9.7
   987P       3.7
   F41       4.6
四、全菌抗原的制备
1、丙酮灭活菌制备参见前述。
2、甲醛灭活全菌制备：以0.4—0。6%甲醛生理盐水与新鲜肉汤培养物等体积混灭菌，经PBS洗涤后，配成1—10X10（6）/ml，4℃保存备用。
3、热灭活全菌制备：将鲜培养物以DW稀释至10亿/ml细菌，100℃水浴2小时，离心吸取上清（另一种抗菌原），菌泥进一步用PBS洗3次，保存备用。
4、酒精灭洗全菌制备。
五、病毒抗原的制备
（一）鸡新城疫病毒提纯—“层析法”
1、鸡红细胞吸附释放法。
鸡红细胞吸附表面有一种糖蛋白受体，在4℃时，病毒被吸附到红细胞膜的受体上，但在37℃时病毒的N—乙酰神经氨酶破坏受体的糖苷键后，病毒又可以从红细胞膜上释放。操作步骤如下：
（1）感染病毒的鸡胚囊液，在4℃下6000r/m，30分钟，弃沉淀。
（2）上清液根据病毒血凝滴度的高低，加入1—3%的新鲜洗涤的鸡红细胞，在4℃下吸附1—2小时。
（3） 3000r/m0分钟，弃去上清。
（4）吸附有病毒的红细胞重悬浮于1X钙盐水中（含4%CaCL2的生理盐水），在37℃下放置2—4小时。
（5） 3000r/m20分钟取上清。
（6） 28000r/m小时，沉淀重悬于小容积的生理盐水中，即为初步纯化病毒。
2、解脱后的病毒蛋白液再上Sepadex  G—200柱，以PBS洗脱，收集第1峰。即为进一步纯化的NDV。
（二） NDV纯化—离心法
1、 NDV种毒以灭菌生理盐水作1：100稀释，再接9—11日龄SPF鸡胚的绒毛尿囊腔内（0.1—0.2ml/胚）。
2、 37℃孵化，每天照蛋两次，收获24—96小时死亡鸡胚的澄清无菌之尿囊液，测血凝价，分装—30℃保存备用。
3、尿囊液经5000Xg  30分钟。
4、取上清102732Xg离心30分钟。
5、再取上清用20%蔗糖垫底，110000Xg离心2.5小时.
6、取沉淀用少量PBS悬浮，经10—60%蔗糖等到密度性梯度离心，91000Xg  16小时（BecKman，L7，SW28）。
7、收集含病毒的蔗糖区带。
8、用PBS稀释上清，110000Xg离心2.5小时。用小量PBS悬浮沉降病毒，小量分装，—70℃保存备用。
（三） NDV  HN  NP  F蛋白制备—SDS—PAGE。
附：聚乙二醇法浓缩病毒
在病毒悬液中加入一定量的PEG6000。在此条件下，病毒可随其他大分子物质发生沉淀。操作步骤如下：
（1）收获经病毒感染的尿囊液，6000r/m30分钟，弃沉淀。
（2）上清液中加入7.5%的PEG 和0.1—00.4MnaCL，4℃下放置2—4小时。
（3） 6000r/m30分钟，收集絮状沉淀物，重悬于小容量的缓冲液内。
六、 MDV羽囊琼扩抗原制备，从略。
七、 IBDV琼扩抗原制备，从略。
八、转铁蛋白制备：利凡诺—低温乙醇分级沉淀法。
1000ml血浆
            加与血浆等到体积的2.0%利凡诺（内含1%Na2CO370ml），
               边加边搅拌产生黄色粘性沉淀物（为白蛋白）
               校正上清PH8.1—8.2，静置3—4小时
（白蛋白沉淀）弃  收集上清液
               加1%活性吸附利凡诺（20分钟）
               抽滤，得澄清滤液
         移入—10℃冷冻
         用1M Hac调PH7.0—7.2
         加乙醇终浓度为25%（乙醇要用Hac调PH7.0—7.2）
         校正PH7.0—7.2
         —60—70℃放2小时
         —4℃离心20分钟（20000r/m）
（球蛋白沉淀）弃
         上清冷至—8℃（调PH5.80+(-)0.05）
         加乙醇至终浓度40%
         调PH5.8+（—）0.05
         —10℃放置沉淀过夜
         —4℃离心，收微红色沉淀（转铁蛋白）
         沉淀溶于5—10倍无热原水中（含0.9%NaCL）
         分装、冻干。
         称干粉重，用水溶解[Pr]至于10%。
         用1%Na2CO3调至PH6.8+（—）0.2,测[Pr]为10%
         将溶液在60℃水浴恒温10小时
         用除菌滤器过滤
         分装5ml/瓶。
注意事项：
1、乙醇要滴加，防止局部变性。
2、 PH要准确控制。
3、温度控制要准确。
4、防止铁被鏊合剂“抓”走。
5、产品应与标准品用条件电泳鉴定。
第三节抗血清的制备程序
一、免疫原的配制
1、福氏不完全佐剂（Ferund’S  adjuvant，imcomplete，FIA）100克石腊油与50克羊毛脂置于盐水瓶中充分涡旋混匀，过滤除菌或高压灭菌（10P15分钟），置4℃
  存放备用。（有市售产品，Sigma）
  2、福氏完全佐剂（Ferund’S  adjuvant ，compelete，FCA）取干粉卡介苗25—250mg
于100ml盐水瓶中草药，加10ml福氏不完全佐剂，于涡旋器上混匀30—60分钟，再加40ml福氏不完全佐剂再混匀10—20分钟，4℃存放备用。（有市售产品，Sigma）
3、免疫原的配制    取等体积的蛋白质溶液与福氏完全佐剂或不完全佐剂分别置于二支洁净灭菌试管中，用2—5ml注射器（配5号针头）吸取约1/5V的抗原溶液，将针头插入佐剂液面下，急速注入油层。置旋涡器上充分混合。用同样的方法分4—5次将其余的抗原溶液与佐剂混合。再于涡旋器混匀30分钟，然后再用注射器反复抽吸，配成油包水“颗粒”，静置15分钟后，观察管底部有无水相析出，如有水相析出，则再用注射器将水相注入油层，并混合之。
制成的油包水乳剂在免疫动物之前需检查其乳化效果，方法是：取一只烧杯装满水，滴数滴上述乳剂于水面，第一滴通常分散开而其他滴呈球状。如也分散开则表明不是油包水乳剂。
3、一些抗原，如全菌抗原、颗粒抗原等，可以不使用佐剂而直接免疫动物。
二、动物的选择
免疫动物的选择应考虑以下几方面因素：
1、动物房的条件及饲养管理水平。
2、抗血清的需要量：1只小鼠仅能提供1.0—1.5ml血,而一只山羊能提供几升。
3、可能提供的抗原量：小鼠通常对50ug或小于50ug的抗原应答良好，山羊可能需要几mg。
4、应考虑提供抗原的动物与产生抗体的动物之间的种系关系。多数情况下，应选用在种系上与抗原供者无关的动物来进行免疫。如高度分化的哺乳动物的蛋白抗原应选用非哺乳动物（如鸡）来生产抗血清。
5、特别注意的是，如果所制备的抗体仅仅是用来检测蛋白质间的微细差异，如同种异型，则可用关系相近的甚至是同种动物来分离抗原和制备抗体。
6、此外，还应考虑所选动物的年龄大小、性别、个体差异等对抗血清生产的可能影响。因此免疫动物只数不宜仅是1只。
三、免疫程序的选择
（一）山羊抗小鼠、兔、猪和鸡Ig免疫血清的制备。
程序一：
1、每只山羊于两侧肩前淋巴结各注射0.5毫升(共含蛋白质量650—1000ug，混于FCA中，FCA—Ag)。
2、 1个月后，采血测效价，如琼凝扩效价未达1：32，则用二倍剂量抗原（混于FIA中，FIA—Ag）于颈部肌肉注射以加强免疫。
3、 2周后再试血，如效价仍未达到1：32，则再加强免疫（同2），直至达到1：32以上。
4、颈动脉放血致死，分离血清，分装，—20℃保存。
成功范例：羊抗鸡血清。
附：琼脂扩散沉淀法测定血清效价。
（1） 1%琼脂凝胶：用含0.065%  NaN2、5Mmedta—Na2的0.01MPBS(PH7.4)配制1%琼脂。
（2）抗血清以0.01MPBS(PH7.4)作1：2—1：256稀释后，加入周围孔，每一稀释度加二孔。中央孔加提取的抗原。
（3） 37℃湿盒内过夜扩散，观察结果。
      程序二：
1、每只山羊于足掌、足趾、后腿部皮下注射2mlFCA—Ag（共含蛋白质量1.2mg）。
2、二周后，二侧腘淋巴结内注射1mlFIA—Ag（蛋白质量为0.6mg）。
3、二周后，后腿部肌肉注射4ml FIA—Ag。
4 、二周后试血，判定标准同上。若达不到效价，继续后腿部肌肉注射4mlFIA— Ag
直至达到1：32 以上。
5、颈动脉放血致死，分离血清，分装之，—20℃
成功范例：羊抗兔血清（1：256）。
程序三：
1、每只山羊背部皮内多点注射6mlFCA—Ag（每点30—50ul，共含蛋白质量600ug）。
2、 1个月后，颈部和后腿部肌肉注射4mlFIA—Ag（蛋白质量用400ug）。
3、二周后试血，若效价达不到，同2继续加强免疫，直至效价达1：32以上。
4、采血，贮存同前。
成功范例：羊抗BALB/C小鼠血清。
      程序四：
1、每只山羊颈部、腿部皮下注射4mlFCA—Ag（共含蛋白质4mg）。
2、二周后，颈部、腿部肌肉注射4mlFIA—Ag，二周后，同法加强免疫一次（6mlFIA—Ag）。
3、二周后试血。若效价不够，继续加强免疫，直至效价达1：32以上。
4、采血并分离血清，贮存同前。
成功范例：羊抗猪血清
（二）兔抗血清的制备
程序一：
1、每只家兔上内多点注射50—200ug蛋白抗原（FCA—Ag）。
2、 1个月后，用提纯抗原静脉注射0.5mg蛋白抗原.
3、 2周后试血,效价不够,可加强免疫一次.。
4、于最后一次免疫2周后，心脏采血致死，分离血清，分装—20℃冻存备用。
成功范例：兔抗大肠埃希氏菌粘附素血清
程序二：
1、第一次静脉、腹腔各注射50mg/只差速离心粗提NDV抗原。
2、第7天重复注射一次。
3、第14天改为腹腔、肌肉注射器，剂量加倍。
4、第21天肌肉注射100mg/只，四脚掌各10mg/只。
5、末次注射后10天采血，分离血清。测HI滴度计算血凝抑制单位。
（三）鸡抗NDV血清制备
第一次用Lasota株鸡胚尿囊液静脉注射1ml/只，腹腔注射4ml/只，以的每隔5天重复注射二次（内含1mlNDV强毒鸡胚尿囊液），共三次，末次注射后第10天采血，测HI滴度。
（四）小鼠抗血清抗原的制备
程序一：可溶性抗原的免疫程序
1、以10—100ug抗原乳化在200ulFCA中（油包水），腹水注射3—12周龄BALB/C小鼠。
2、 4—6周后，以同样剂量抗原乳化在FIA中，作1—2次追加免疫（i.p），间隔时间为2—3周。（可试血、采血）。
3、以等量或加倍量抗原的PBS 溶液作最后一次免疫，2—4天后取脾细胞可作融合试验用。
程序二：细胞性抗原的免疫程序
1、细胞用PBS洗3—4次以除去血清成分。
2、以10（7）细胞/只剂量腹腔注射BALB/C小鼠。
3、 3—8周后作追加免疫力。（可重复1—2次）。
4、最后一次免疫2—4天取脾细胞供作融合。
程序三：短程免疫程序
1、全菌抗原5X10（6）/只腹腔注射；（或用提纯抗原40ng/只  i.p）。
      2、2—3周后，腹腔注射提纯抗原40ng/只（若每间隔2—3周用全菌抗原后提纯抗原加强免疫5—6次，此乃“密集型”免疫程序）。
2、 3天的取脾细胞可供融合用。
（五）体外免疫程序
Development  of  a  serum—free  medium  for  in  vitre  immune  responses  by using  b—cyclodextrin
J  Immunol  Methods  1998:112:227—233
（六） IBDV血清生产（从略）
      第十章    细菌学试验中的几个常用技术
第一节；菌总数估测
一、比浊法
1、莫法兰德浊度计的制备
按下述方法制备标准硫酸钡悬液。
（1）制备一份1%的C.P(化学纯)硫酸溶液。
（2）制备一份1%C.P氯化钡溶液。
（3）制备下述10个标准悬液：
加（1%氯化钡溶液ml数）于（1%硫酸溶液ml数）
1 99
2 98
3 97
4 96
5 95
6 94
7 93
8 92
9 91
10 90
（4）取各标准硫酸钡沉淀的悬液3ml左右，封存在一支试管内。试管必须仔细挑选，使其直径、色泽和管型的厚度都一致。
2、目测待检样品与几号管浊度相近，并按下列关系，估计细菌浓度：
            管号                细菌含量
1 3亿
2 6亿
3 9亿
4 12亿
                  ……                   ……
二、常规平板计数法
1、将待测均质样品制备10（-2）10（-3）10（-4）……等适度的十进制稀释液，其方法系以无菌吸管吸取10ml原稀释液，加于90.0ml稀释液中（有时可采用1.0ml+9.0ml）混匀。注意：稀释每个滴度的吸管都要更换，操作中防止出现泡沫。
2、用吸管以每一个稀释液内吸取1.0ml，分别加入到有适当标志的平皿（15mm X100mm）内。注意：如果稀释菌液静置的时间超过3分钟，则在吸取前，必须重新混匀。
3、于每个平皿内各加12-15ml标准法琼脂（冷至44-46℃。琼脂在45℃水浴中保温备用）样品的每一个稀释系列做一个只加稀释剂倾注琼脂的对照平板。
4、立即转动或在一个平面上前后倾动平皿，使样品稀释液和琼脂培养基充分混合均匀。
5、待琼脂凝固后，翻动平板，迅速防于35℃恒温箱内培养 48h+（-）2h。
6、培养后，在适当范围的双列平板用菌落计数器计数菌落数，记录每一个稀释度的平板计数结果。
7、在三个稀释倍数中，至少应有一个稀释倍数的两个平板其菌落数在30—300个的范围之内。根据菌落数和稀释度计数样品中的需要平板数。
8、所有从菌落数少于30个或多于300个的双列平板计算而得的需氧平板计数数，都报告为估算数。
附：1、标准法琼脂（平板计数琼脂）
               胰蛋白胨          5g
               酵母浸膏          2.5g
               葡萄糖             1g
               DW                15g
               PH7.0+(--)0.1       121℃15分钟
   2Butterfield氏缓冲液
      基础溶液：
               磷酸二氢钾          34g
               D.W.             500ml
      用1N氢氧化钠将PH值调整至7.2，加蒸馏水至升。121℃高压灭菌15分钟，贮于冰箱。
      稀释的定量瓶装（使用液）：
      取上述基础液1.25ml,加D.W.达1000ml,分装于瓶内,每瓶99或99+(--)1ml。
      121℃高压灭菌15分钟。
三、直接显微镜检查法（Official  first  action  method，法定试行方法）。
1、在油镜下用显微镜测微尺测定每个视野的直径d，则视野的面积为：
   Af=（）（d/2）（）。
2、每一平方厘米涂膜的视野数应为
      AF       1cm（）
      ——— =——————
      Af       Af[cm]（）
3、每个涂膜含0.01ml样品,则1.0ml样品的视野数应为：
                     AF
         FF=100X————
            Af
4、每ml样品中的菌数即为：
DMSCC（）/ml=[FF]X[每个视野的平均菌数]
（direct  microscopic  somatic  cells  count  直接显微镜菌体细胞计数）
5、 FF和检查的视野数（至少10—60个）都为已知数，故可作为一个系数，称视野工作系数（FWF）代入上式而得：
DMSCC/ml=[FWF]X计数的总细菌数
6、菌液涂膜的制备：
（1）吸0.01ml样品,置于洁净、干燥的载玻片上；
（2）将菌液涂成1cm（）的涂膜；
（3）将玻片放于35—40℃，至涂膜干燥；注意保持玻片的水平。
（4）浸于二甲苯中1min，再浸于95%酒精中1min；
（5） North苯胺油亚甲蓝染色剂中染色1—20min；
7、漂洗玻片，镜检前在空气中充分干燥。切忘用吸墨纸吸干。
附：North苯胺油—亚甲蓝染色液
   苯胺油（Aniline  Oil）    3ml
   酒精（95%）             10ml
   盐酸（浓）                1.5ml
   亚甲蓝(饱和溶液)          30ml
   蒸馏水,加至                1000ml
将3ml苯胺油与10ml酒精相混合,在不停在搅拌下徐徐加入1.5ml盐酸.。加30ml饱和亚甲基蓝溶液，用水稀释至100ml，过滤。
四、分光光度计测定法
a、波长选择420nm，550nm，600nm。
b、下列回归方程为420nm条件下建立。
第一组
（1）大肠杆菌
lgy（）=7.1370+2.7878X
      (2)金黄色葡萄球菌：
      lgy（）=7.4722+4.7259X
（3白色葡萄球菌：
   lgy=6.9067+2.6950X
（5）白色念珠菌：
  lgy=5.9512+2.1948X
有效测定范围在103___106ofe/ml
                                       (摘自俞晓峰文章)
第二组
(1) 沙门细菌(S.pullorm)
未离心肉汤:lgy=7.3461+7.5306X
离心菌悬液:lgy=7.3112+7.7191X
(2) 大肠杆菌:
未离心肉汤:lgy=7.4197+1.2113X
离心菌悬液:lgy=7.3764+5.8632X
五、最近似数（MPN）（the  most probable  numbers）是一个代表作用物中活菌浓度的估计数。这个数是应用机率的原理测定作用物（样品）中细菌的总浓度而推知的。请参阅有关文献。

第二节几种常用细菌培养基的配方
一、Minca  Med    1000ml（Minca—Isoritalex）
   KH2PO4 1.36g
   NA2HPO4.12H2O 25.3g(NA2PO4.12H2O 10.1g)
   Casamino acids 1g (Difco)
   Trace  salts solution’ 1ml’
   agar(Difco)    12g
   PH7.5 10P.10分钟消毒
   (Isoritalex(BBL):1  ampoule)
*Trace salts solution(100ml)
MgSO4.7H2O       10g
MnCl2.4H2O       1g
FeCl3.6H2O       0.135g
CaCl2.2H2O       0.4g
100℃灭菌。
二、SLANETS MEDIUM
Bacto  tryptose    20g       glucose          1g
NaCl                   9g       bacto  agar    18g
A．D．W             1000ml
四、 BBL培养基
（1）大豆胨       10g
Trypton  or Bacto—pepton
orpretose—pepton                      10g
NaCl                                        4g
KH2PO4                                     1g
牛肉汤                                        1000ML
agar                                        20—30g
PH7.6 15磅 15分钟灭菌
或（2）Trypton or    Bacto—pepton          10g
   NaCl                                        3g
   NaH2PO4                                     2g
   兔汤                               500ml
   牛肉汤                            500ml
   agar                         20g
      PH7.6  15P15’
或(3) 酪蛋白水解物             20g
   大豆胨                10g
      NaCl                   3g
      NaH2PO4                2g
      PH7.6 15P  15’
四、TEM Med
Lab__Lemco          5g
bacto__tryptose(Difco)    10g
NaCl                   3g
Na2HPO4.12H2O                2g
glucose                   0.5g
yeast  extract(Difco)    5g
*Trace element    solution       5.0ml
PH7.3
bacto agar(Difco)             25g
A.D.W                               1000ml
120℃  15’
*Trece    ekement    salt
FeSO4.7H2O          0.5g
ZnSO4.7H2O          0.5g
MgSO4.3H2O          0.5g
1N  H2SO4             20ml
A.D.W                   1000ml
五、 M肉汤
1、Trypticase soy  Broth
Trypticase    17.0g
phytone       3.0g
Glucose       2.5g
15p.s.i for  15min
Dipotassium  phosphate    5.0g
D.W                   1000ml
PH7.3
2、Tryptone  Broth
Trytone                10.0g
D.W.                      1000ml
3、M    broth
   an equal  mixture of(1) and  (2)
六、其它各类培养基参见有关书籍。
第三节常见细菌的分离鉴定
按常规程序进行各类细菌分离鉴定，请参阅有关书籍。这里仅以肠杆菌科沙门细菌的分离鉴定为例简要概述，下面是该菌的分离鉴定的流程图：
                     被检材料

内脏组织上          粪便、肠内容物理学                各类食品、饲料等

                                                         前增菌
                     增菌培养（24—48小时）

                                                         选择性增菌
                  鉴别培养基（24h）
                  三糖铁琼脂（24h）
几次常规生化          尿素酶                多价抗O血清
试验鉴定             测定                      试验

                                                            ELESA试验、
                     结果判定                         FA试验、噬菌体系统
                                                            DNA杂交试验等

动物试验             O单因子血清测定             鉴别生化试验
         H血清鉴定
         结果判定
第十一章    细胞免疫学试验程序
   第一节玫瑰花环试验（E—ROSETTES ASSAY）
一、总E花环（ERYTHOCYTE TOTAL  ROSETTE，Et），或称晚期玫瑰花环，淋巴细胞+SRBC等，37℃，低速离心——4℃  2小时——检测。
E的百分率（花环形成的细胞X100/总计细胞数）和绝对数可代表被检标本中全部T淋巴细胞的百分数和总数。E是目前鉴定和计算外周血液和各种淋巴样组织中T细胞的最常用方法之一。
二、活性E花环（ERYTHOCYTE ACTIVE  ROSETTE， Ea），或称早期玫瑰花环。淋巴细胞+SRBC或其它动物红细胞——低速离心沉淀——检测。
Ea与T细胞的体内外功能活性密切相关，能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一。
三、操作步骤
1、静脉采血，以肝素作为抗凝剂，每毫升血含20UL或0.2mg；若为以EDTA—Na2作抗凝剂1—2mg/ml血。一般认为EDTA—NA2比肝素好，因为T淋巴细胞、RBC、肝素均带负电，有相互排斥。
2、淋巴细胞的分离淋巴细胞比重在1.077___1.080之间,红细胞和粒细胞比重为1.092。配制1.077___1.080高分子液进行密度梯度离心,高分子溶液的主要成分是蔗糖,商品名为FICOLL
取抗凝血1.0ml,加等量HANK’S液(无钙镁,PH7.4)稀释后,用毛细吸管沿管壁缓慢加入装有淋巴细胞分层液的试管内,使血凝重叠于分层液上,用水平离心机以2000R/M30分钟离心。此时红细胞沉降至最下层，上层为血浆，中层为分层液，血浆与分层液的界面有一白色挟带为淋巴细胞和单核细胞。
以毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单核细胞，置于离心管中，用HANKS液以1000r/m10分钟洗2次，以HANKS液配成107个细胞/ml的细胞悬液。
3、1%RBC悬液的制备    取阿氏液保存的血液，以HANKS液洗3次，2000r/m10分钟离心后，将压积红细胞用HANKS液配成1%悬液，含红细胞数约108/ml。
6、 Ea花环0.3ml淋巴细胞悬液+1%RBC 0.3+0.1ml灭活小牛血清___混匀___37℃25分钟___1500r/m5分钟___此培养物即可作涂片或滴片观察.
5、E1花环:上述培养物中再加入0.8%戍二醛1滴,轻轻摇匀混合,置4℃冻箱中作用2小时(或过夜)。取出后，轻轻旋转试管，使沉淀的细胞重新悬浮，用毛细管轻轻混匀。
7、制片镜检
（1）湿片    取上述培养物一滴加于事先铺有瑞氏染液的玻片上，覆以盖玻片，在高倍镜或相差镜下观察。凡吸附4个或更多RBC的单核细胞为RE花环形成细胞，共计数200个细胞，算出百分率。
（2）干片    取培养物1滴于载玻片上涂片、干燥，滴加甲醇固定5分钟，用PH6.4PBS冲洗,取I液染4分钟,冲洗,再加II液染色4分钟,冲洗,待干,镜检。红细胞染成红色，淋巴细胞染成蓝色。
附1 染液配方
I液    瑞氏粉0.1g,甲醇60ml,研碎混匀.
II液姬姆氏粉0.5g,纯甘油33ml,甲醇33ml,先将姬姆氏粉溶于甘油中,并置60℃温箱中,最后加甲醇即可.
使用时,分加将I液和II液用PH6.4PBS稀释一倍.
附2    试验条件选择
1、人、猪、牛、羊淋巴细胞——SRBC：
2、马、犬淋巴细胞—豚鼠RBC：
3、豚鼠淋巴细胞——家兔RBC：
4、 RBC：LC=50—100：1
5、染液亦可用0.2%美兰, Giemsa ___Wright氏液.
                  第二节    淋巴细胞转化试验
                     （LYMPHOCYTE  TRANSFORMATION  TEST）
淋巴细胞转化试验是体外检测淋巴细胞功能的一种方法。Tc与特异性抗原或非特异促分裂因子在体外共同培养时，细胞代谢和形态发生一系列的变化，代谢旺盛、蛋白质和核酸的合成增加，细胞体积变大，转化为能分裂的淋巴母细胞。转化率的高低反映机体的免疫功能状态，这种方法为淋巴转化试验。
一、试剂配制：
1、 DMEM+10%FCS
2、肝素2000U/ml
（4万单位溶于20mlPBS，过滤除菌；使用时0.1ml肝素+10ml血）
3 无Ca++、Mg++，PBS，灭菌
4、0.2%台盼蓝
5、PHA80ug/ml
0.8mgPHA+无菌10mlDMEM+10%FCS中;
6、H—THYMIDINE
1mCi/ml的液体0.5ml___溶于50mlDMEM+FCS液中,终浓度为1uci/100ul.
7、消化液20ml
浓甲酸       15ml
H2O2（30%） 5ml
8、液闪液（所有器皿需烘干）
PPO       5g
POPOP    2.5g
溶于200ml无水乙醇+800ml甲苯,摇匀;
9、MTT
二、外周血淋巴细胞PBM制备
1、 10ml肝素抗凝血；
2、 50g，4℃10—15min；
3、收集上层液体；
4、用DMEM+10%BFS洗一次；
400g 4℃  10min；
5、吸弃上清，加5mlDMEM+10%BFS；
6、活细胞计数（方法见前）
调整细胞浓度至2X107/ml
三、同位素法测定转化后的细胞活性
1、按下列方式分别加入淋巴细胞悬液和PHA：
1          2          3          4             5             6
A
B
C
D
(1) 淋巴细胞浓度2X107/ml，每孔加入0.5ml,终浓度为1X107/ml;
(2) PHA浓度80  40  20  10  5  0ug/ml,每孔加入0.5ml,终浓度为40  20  10  5  2.5  0;
2、 37度CO2箱内培养56h;
3、 A、B两排每孔加1uci、’H-thymidine;
4、继续培养16小时;
5、收集A、B、C排细胞于离心管内；
6、 400g10min，弃上清；
7、 A、B排细胞沉淀用PBS洗一次，400g×10min；
8、放射性测定；
（1）A、B离心馆开盖80度烘干，2-3小时；
（2）每管内加消化液200ul；
（3）盖好，90度水浴1小时；
（4）每管取100ul置液闪瓶内；
（5）每瓶加4ul闪烁液
（6）液闪仪测定
刺激指数SI= 加PHA管的CPM均值
         ——————————————
                  对照管CPM均值
四、形态学方法：
1、 C排管内细胞沉淀物涂片
2、 GIEMSA——WRIGTH染色
3、镜检
200个LC,计算转化率
      转化率（%）=转化LC/淋巴细胞总数
五、 MTT法
MTT法是一种四甲基偶氮唑盐[3—（4.5- dimethyl__thlazd-2-yl）-2.5-diphenyl-terrazolium  bromide]淡黄色，易溶液于水，MTT经活细胞线粒体中的脱氢酶作用后可氧化成蓝色结晶甲襸，甲襸经异丙醇作用后溶解显色，此法简易，准确且无同位素污染，以此法代替H’—TDR掺入法可进行细胞代谢活性及增殖反应的测定。
1、不同处理的细胞加入96孔细胞培养板中，每孔100ul，37℃6%CO2培养。
2、培养结束前4小时加入100ul/孔MTT试剂。
3、培养结束后，取出培养板，4℃下1500r/m离心7分钟，甩去上清。
4、立即加入10%盐酸一异丙醇，100ul/孔，充分吹吸混匀。
5、于DG一3022型酶联免疫仪上测定OD570nm、OD650nm，求出OD550值。
第十二章动物实验的一般规则
一、依据实验目的要求，如病毒LD50、LD100、ID50等、细菌毒力测定、免疫效力试验、免疫血清制备等，选择不同种类、品系及不同饲养管理条件下的实验动物式实验用动物。常用的实验（用）动物包括小白鼠、大白鼠、豚鼠、绵羊、山羊、小香猪、他猪八戒、家兔、鸡、鸭、鹅等十几种。其中部分动物又有自然繁殖、近交系等、SPF与非SPF等区分。
二、依据动物骒病原体的敏感性或骒接种物的应答性不同，确定选用动物的年龄、性别，特别是使用动物的数量。
四、不同实验研究类型所要求的动物数量不相同，现简述如下：
（一）现况研究（Cross-sectional study）的一般样本大小可用下列公式计算：
      S．E．=PQ/N
      S．E．=标准误，P=某病的现患率或感染率，Q=1-P，N为样本大小。根据上述公式，可得到下列简便公式。
1、若容许误差d=0.10P,95%可信水平t=2样本的感染率P与总体感染P之间有差异d。P-p=+（-）d=+（-）txS.E,S.E.=d/t.0.05水平,自由度为无限大时,t值约为2.
P.Q       P.Q          t（2）PQ
N=————  =—————— =——————
         (S.E.)（2） (d/t)（2）       d（2）
         令d=0.1P
            2（）PQ          4PQ             Q
         N=———————— =———————— =400X——
            （0.1P）()       0.02P()             P
2、若容许误差d=0.15P,则
         Q
N=178X——
               P
3、若容许误差d=0.20P,则
N=100XQ/P
4、抽样调查肿瘤或其它发病率很低的疾病时，样本大小可参考Poisson分布期望可信限表。
（二）病例对照研究（case-control  study），又称回顾性研究（retrospective  studies），研究样本大小可按下列分式计算。
         N=————————————

      Ka与Kb分别为a与b时正态分位数。可以队表中查得。
      P1和P2分别为估计对照组与病例组有暴露史的比例。
      Q1=1-P1，  Q2=1-P2
      P=（P1+P2）/2，Q=1-P
      另，病例的暴露史可用下列公式估计：
      P2=（ORXP1）/（1-P1+ORXP1）
      OR为比值比。
                        附表  正态分布的分位数表
  KA（单侧检验）
  KC（单侧和双侧检验） Kb（双侧检验）
3.090
2.878
2.576
2.326
2.058
1.960
1.645
1.282    3.290
3.090
2.807
2.576
2.326
2.242
1.960
1.645
（三）队列研究（cohort study）,又称前瞻性研究(prospective studies).研究样本大小可用下列公式计算：

但这里P1为暴露组的发病率，P0为非暴露组的发病率。
Q1=1-P0  ，                Q0=1-P0
P=（P0+P1）/2，             Q=1-P
如已知P0与估计某相对危险度（R），则
P1=RP0
（四）实验研究
1、对于发病率在5%以上的疾病作实验研究时，两组需要的动物数（N1及N2）可用下列公式计算：

可信限为95%。T值为1.96按2计算。式中P1为对照组的预期发病率，q1=1-p1;p2为实验组的预期发病率， q2=1-p2;N1为对照组需要的观察数。
设N1=N2，上式中仅N为未知，将p、q值分别代入公式即可得N值。
2、对于发病率在5%以下，尤其是在1%以下的低发病率疾病的调查研究时，常采用泊松分布来推导样本数。
四、试验动物数的多少，除用上述公式计算和查表外，还应考虑以下几个因素：
1、疾病的罹患率高低。
2、实验措施有效率的高低。
3、要求实验精确度的高低。
4、要求实验组和对照组差异显著性的程度。
5、两组的均衡性即齐同必的好坏。
6、实验分组越多，则样本世纪数就需要增长率大。
五、实验动物的分组必须考虑各组中动物的齐同性、随机性、重复性等，尽量减少实验田的偏差。实验动物的随机性分组方法详细参阅有关书籍，常见方法有完全随机设计、配对设计、随机单位组设计和拉丁方法设计和正交设计等。
六、实验中必须设立严格合理的对照。通过对照组可取得研究指标的数据差异、清除被试因素以外的其它因素对结果的影响等。
七、使用实验动物务必记住节约二字，需要什么样的动物园就使用什么样的动物园，不要越级使用。在周密的设计和论证的基础上，再提出实验田动物的订购计划。
八、正式实验之前的充分准备工作可以起到事半功倍的效果，通常预试期可以达到下列目的：
1、使试验动物园习惯于试验期的环境条件。
2、做好试验动物的长势、驱虫、防疫注射等项准备工作以及对它们的健康观察。
3、训练试验人员，熟练掌握操作规程。
4、考核试验设计是否恰当和切实可行，发现部题及时纠正。
5、通过预试期得到统计数据，对试验动物进一步审查、调整。一般要求预试期试验动物园头数应多于正式试验的头数；预试期的长短可因试验要求而定，一般为15——20天。
九、实验结果必须进行统计分析。
十、几个使用动物园进行实验的范例
1、 Z4+HVT二价活苗的实验室免疫效力试验；
2、 Z4保护力及其致瘤性测定；
3、应用粘附素单抗治疗仔猪下痢的研究；
4、免疫血清的制备；
5、病毒常规毒力指标测定（包括使用鸡鸭鹅胚）；
6、细菌毒力测定等。
第十三章电泳技术、层析技术
   有关电泳技术、层析技术已分别在前面各章节中讨论，这里不再单独赘述。对于刚开始实验工作的人员请详细参阅：
1、 Mononlonal  Antibodies：Principle  and  Practice James W.Goding
2、生化实验技术与原理
隋德新
单克隆抗体:原理、方法及应用
刘秀梵

第四部分    家畜传染病学实验指导

目录
家蓄传染病学实验规则
附  学生实验守则
家蓄传染病实验报告内容
实验一  碳疽的诊断
实验二  巴氏杆菌病的诊断
实验三  结核杆菌病和布氏杆菌病的检疫
实验四  猪瘟的诊断
实验五  鸡新城疫的诊断
Ⅰ、鸡新城疫病毒的鸡胚分离
Ⅱ、免疫荧光实验
Ⅲ、HA和HI试验
实验六鸡马立克氏病的琼扩诊断
实验七  沙门氏菌快速检验试验
实验八  鸡白痢的检疫
家蓄传染病学实验规则
1、实验前必须穿好工作服，实验后必须认真洗手后方可离开实验室。
2、实验室禁止饮食、吸烟，勿以手指、器械等与面部接触，以防感染。
3、操作时务须聚精会神，严肃认真，不得顾盼言他。
4、污染的器皿及废弃病料、污水等均应严格按规定处理。
5、菌种、毒种不得擅自带出实验室。
6、爱惜实验器械，若有损坏应主动登记、报告。
7、保持实验室安静、整洁。
8、实验后，必须关好水电，清洗整理好本小组物品。
9、每次实验完毕，值日生应认真预习，熟悉实验内容，实验完毕应以科学态度写出实验报告。
附一学生实验手则
1、实验前应认真预习，经教师质疑不合格者不得进行实验。
2、服从教师指导，按规定和步骤进行实验，认真地观察和分析实验对象，如实地记录实验数据，不得抄袭他人实验结果。
3、要注意安全，爱护实验用具和设备，节约水、电、气和实验材料等。
4、进入实验室或实验场地，必须衣着整齐，保持安静，严禁谈笑喧哗、抽烟、随地吐痰，更不得动用与本实验无关的其他仪器设备或教学标本等。
5、认真作好实验报告，凡不合格要求者，均须重做。
6、实验完成后，主动整理好实验用具，关好水、电、气流，搞好清洁卫生。
7、凡违反实验规程或擅自动用其它实验用具、设备而导致损失者，必须写出书面检查，并按要求赔偿损失，情节严重者给予纪律处分。
家蓄传染病实验报告内容
1、送检病例情况简述。
2、诊断程序和结果。
3、诊断意见。
4、分析和讨论实验结果。
5、实验诊断注意事项。
实验一  炭疽的诊断
一、目的
掌握炭疽的实验室诊断步骤和方法；
学习和复习实验室的基本操作方法；
二、实验器材
试管架铁丝篓酒精灯酒精棉球碘酒棉球剪刀镊子解剖台纱布搪瓷盆解剖刀铂金耳消毒试管载玻片擦镜纸镜油染色缸吸水纸滴管平皿离心机天平玻璃铅笔
10%甲醛溶液美兰染色液瑞氏染色液革兰氏染色液普通琼脂平板血琼脂平板肉汤培养基毛细滴管滴头炭沉管纸盒炭疽沉淀血清1%新洁尔灭消毒液0.2%升汞消毒液新鲜移植菌种斜面纯培养小白鼠
三、实验动物的准备
实验前一周着手准备，在严格隔离条件下进行，将炭疽杆菌菌种移植到一支肉汤培养基中，37℃培养12-18小时，用此幼龄培养物，小白鼠皮下或腹腔注射0.1-0. 2ml/只，小白鼠在注射后2-3天死亡，死鼠冷藏供实验用。
实验前一天，分别移植炭疽杆菌和枯草杆菌到血斜面上进行培养，供实验时做对照用。
四、实验步骤
1、无菌操作解剖小白鼠，从小白鼠脾脏或肝脏作细菌分离培养于普通平板、血平板和肉汤培养基中。
2、取脾、肝或血液在载玻片上作触片或涂片。
3、用炭疽杆菌纯培养物和枯草杆菌纯培养物在另一块载玻片上作涂片。
4、待步骤2、3中的触片和涂片自然干燥，火焰固定，在5-10%甲醛溶液中浸泡10-15分钟，灭活细菌，置玻片架上晾干。
5、组织触片用美兰染色，纯培养物用革兰氏染色，镜检，观察细菌形态。
6、 Ascolis反应
取脾脏、肝脏数克剪成小块，置消毒试管中，加3-5倍量生理盐水，隔水煮沸30分钟，2000转/分离心15分钟，吸取脂肪层下的溶液与炭疽沉淀血清作Ascolis反应。
示教实验    串珠试管
五、思考题
1、炭疽杆菌的形态特征和培养特征主要有哪些？与枯草杆菌有什么区别？
2、 Ascolis反应的原理是什么？它在炭疽诊断中是否可靠？为什么？
3、炭疽杆菌在什么情况下能形成串珠现象？
4、肉联厂发生了疑似炭疽，应如何尽快进行诊断和处理？
实验二    巴氏杆菌病的诊断
一、目的
观察鸡巴氏杆菌病的临床表现和病理变化；
掌握巴氏杆菌病的实验室诊断方法。
二、实验器材
美兰染色液　　瑞氏染色液
载玻片　　染色缸　　吸水纸　　显微镜　　镜油　　擦镜纸
试管架　　铂金耳　　酒精灯　　镊子　　剪刀　　生理盐水　　
肉汤培养基　　血平板　　酒精棉球　　0.1%新洁尔灭消毒液
送检鸡
三、实验动物的准备
１、移植鸡巴氏杆菌强毒株于一支血斜面和一支肉汤培养基上，３７℃培养２４小时。
２、用生理盐水洗下血斜面上的巴氏杆菌菌落，制成菌悬液，取２０ｍｌ注射于小白鼠腹腔，小白鼠在２４－４８小时内死亡。
３、无菌操作解剖死鼠，去死鼠肝脏触片，染色，镜检，若确为巴氏杆菌致死，则取出肝脾于玻璃磨碎器中，加入５－１０倍量的肉汤培养基或生理盐水，磨碎，制成组织悬液，取该悬液0.3-0.4ml注射健康鸡,肌注，通常鸡在注射后24小时死亡，死鸡供实验用。
四、实验步骤
１、解剖鸡。无菌操作，自肝脏作细菌分离于血琼脂平板，37℃培养16-24小时，观察培养结果。
２、取肝、心血制触片或涂片数张，美兰和瑞氏染色，镜检，观察细菌形态。
３、仔细观察死亡鸡病变（肌肉、皮下、肝、心包、心冠脂肪、肺、浆膜、粘膜等脏器组织病变），并做记录。
４、示教组织中的巴氏杆菌。
五、思考题
１、巴氏杆菌的菌落和培养特性是什么？
２、为什么巴氏杆菌成两极染色？
３、什么是巴氏杆菌的荧光现象？与致病菌性有无关系？
４、巴氏杆菌能致多种动物的疾病,其主要特点是什麽?
５、从病猪脏器分离到巴氏杆菌,,是否就可以确诊为巴士杆菌病?为什么?
６、研制巴士杆菌疫苗要注意什么问题?

                     实验三结核杆菌病和布氏杆菌病的检疫
一，目的
      掌握结核杆菌病的变态反应诊断方法;
      掌握布氏杆菌病的血清学诊断方法..
二,实验器材
消毒盒剪毛剪镊子游标卡尺纱布  变态反应用金属注射器和针头结核菌素记录表酒精棉球搪瓷盘  兽用16号针头贴有标签的无菌5ml试管胶鞋
  试管架干净试管干净吸管(1ml或5ml)100ml三角烧瓶    0.05%石炭酸生理盐水布氏杆菌阳性诊断血清布氏杆菌试管凝集试验用抗原被检牛血清振荡器  布氏杆菌阴性诊断血清
三,实验步骤
(一) 第一次实验（地址：牛场）
内容:变态反应皮内试验和采血
1,将牛固定好.
2,在成牛颈侧中部上1/3处剪毛,直径为10cm
3,用游标卡尺测量术部中央皮皱厚度并作好记录
4,术部用酒精棉球消毒
5,向术部中央注射0.2ml结核菌素,注射时应同时向前和向皮肤内用力,将针头斜向刺进皮内,并应立即用左手固定针头,或手慢慢将结核菌素注射进皮内。抽出针头后,用手指检查注射部位是否有突起的硬块,若无硬块必须重新注射。
6,寻找颈静脉.
7,在颈静脉处剪毛，术部用酒精棉球消毒.
8,左手按住颈静脉的术部向心端,右手将16号针头垂直或沿颈静脉走向斜向刺入颈静脉,调整针头插入深度使静脉血从针头流出,立即用消毒试管收集流出的血液，在采血的过程中，左手始终要按紧颈静脉的术部向心端,扎针时要看清突起的血管，果断用力，力求一针见血.
9,每头牛采3-5ml血液，送开左手后,右手拔出针头,用酒精棉球消毒术部，在收集血液的试管上标记上相应的牛号.将采有血液的试管斜放，待凝固后，带回实验室分离血清，以便进行布氏杆菌凝集实验.
   结核菌素点眼试验(操作示范)
(1) 保定牛。
(2) 仔细检查牛眼睛，发炎者不能做点眼试验.
(3) 用左手拇指和食指将牛眼的上、下眼睑分别向上、下翻张使眼结膜囊暴露，右手用1%硼酸棉球擦去眼周围活物.
(4) 右手用滴管将结核菌素-5滴滴入眼结膜内，滴管头不要接触眼结膜。
(二) 第二次实验（地址：牛场）
1 ，变态反应皮内实验。必须在第一次注射结核菌素后，分别在７２小时和第１２０小时观察注射局部的反应情况。主要是观察有无炎症反应,并测量皮皱厚度和肿胀面积的大小，据此判定试验结果，对第72小时观察，反应呈阴性或可疑的牛只须立即在第一次注射的同一部位，以同一剂量进行第二次注射，剂量同第一次。第二次注射后48小时(即第一次注射后第120小时)应在观察一次.观察情况均有详细记录。
变态反应点眼实验应于点眼后3,6,9小时各观察一次,并作好记录，必要时可观察第24小时的反应,观察时可作翻眼检查
（三）分离血清步骤
１、将试管中凝固的的血清检样，2000转/分离心15分钟。
２、将血凝块上的血清用滴管吸至另一空的消毒试管中，然后将原试管上的牛号标签贴至血清的试管上。
３、如果离心后仍无血清析出，可用干净铁丝插入管底，沿管壁移动铁丝使血凝块与试管分离，再离心，并重得步骤2。
４、血清置4℃冰箱保存，72小时内作布氏杆菌试管凝集试验。
（四）布氏杆菌试管凝集试验
１、操作方法表解如下：

试管号 1 2 3 4 5 6 7
稀释倍数 1：25 1：50 1：100 1：200 1：400 阳性对照阴性对照
试
液

0.5%石炭酸生理盐水 2.4

  0.1

  0.5 0.5

  0.5 0.5

0.5 0.5

0.5 布氏杆菌阳性诊断血清(1:100)
  0.5ml


弃0.5ml 布氏杆菌阴性诊断血清(1:100).

0.5ml
布氏杆菌诊断Ag(1:20)  0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
充分振荡,混匀,37℃温箱24小时,观察结果
２、比浊管制备
3.5%石炭酸生理盐水
布氏杆菌诊断Ag液(1:10)

清朗度
标记
1.0
0.75
0.5
0.25
0.0
0.6
0.25
0.5
0.75
1.0 100%
75%
50%
25&
0.0% ++++
+++
++
+
-
３、判定结果并记录
四、思考题
１、本试验中，如何观察结果？确定为结核杆菌或布氏杆菌病阳性、可疑的标准各是什么？对阳性或可疑牛应如何处理？
２、犊牛变态反应皮内法的试验部位是什么？注射剂量是多少？羊布氏杆菌凝集试验用什么稀释度？
３、家畜布氏杆菌的诊断方法有哪几种？其优点各是什么？
４、在进行牛结核病菌变态反应诊断时，什么情况下春用皮内法？在什么情况下需同时用皮内和点眼两种方法？为什么？
               实验四猪瘟的诊断
I免疫酶组化法
一、目的
了解免疫酶组化法的一般程序和酶标记技术：
掌握用免疫酶组化法诊断猪瘟的方法。
实验器材
  剪子、镊子、100ml染色缸。载玻片、玻片ml试管、滴头、1ml吸管、脱脂棉、吸水纸、擦镜纸、显微镜、橡皮膏、酒精灯、铂耳、1000ml烧杯、铜蓝、搅拌器、磁捧、酒精棉球
500ml量筒、500ml三角烧瓶、大滤斗。
酶标抗体、PH7.2 0.015M PBS、1%NaN2、1%H2O2、Tris_HCL缓冲液、DAB 、4℃丙酮、病猪血液（抗菌素凝血）、病猪脏器、水浴箱。
二、溶液配制
１、 PH7.6  0.05Mtris_HCL缓冲液:
   0.2M  Tris(24.24g/l)    250ml
   0.1N  HCL(8.4ml/L)       375ml
   NaCL                         7.6g
   DW                            1000ml
2、0.01%H2O2、NaN2、PH7。6  0.05M  Tis-HCL,缓冲液,用作内源酶灭活液:
   取PH7.6  0.05M  Tris-HCL缓冲液98ml,加1%H2O2 1ml和1%NaN2  ,1ml即成.
3底物液：PH7.6  0.05M  Tris-HCL缓冲液100ml加DAB75mg,避光搅拌3小时,使其溶解,滤纸过滤.临用前加工厂%H2O2  0,5ml.
四、实验动物的准备
用猪瘟自然病例或人工感染猪病料作实验。
人工感染需要在实验前四天用猪瘟强毒（血毒）注射40斤左右的猪瘟易感猪，2ml/只，肌注。猪在3-4天后发病死亡，临死前采猪心脏血，抗凝，以备做白细胞涂片。
解剖猪，采淋巴结、脾、扁桃体，各做组织触片。
五、实验田步骤
１、制片
（1）取试管中抗凝血浆层置另一空试管中3000r/ml15分钟，弃血浆，用生理盐水将试管中的沉积细胞洗一次，最后用0.1-0.3ml生理盐水悬浮沉积细胞,取2铂耳在载玻片上作2个均匀的涂片.自然干燥.
（2）用脾、肾、淋巴结、扁桃体等脏器中的一种在载片上作两个横切触面，自然干燥。
（3）对两张片子作正反、左右标记。
２、固定
将玻片置染色缸中，用4℃丙酮固定10分钟。
３、灭活内源酶
取内源酶灭活液100ml于待检玻片的染色中，室温灭活30分钟，将玻片取出，流动的PBS洗15分钟，再换去离子水洗10分钟，取出玻片，自然干燥。
４、酶染
用1mlPBS溶解一支冻干猪瘟标抗体制剂，在玻片左边的触（涂）面上滴加2滴猪瘟酶标抗体液并涂开，使其覆盖触（涂）面，右边用PBS覆盖作对照，将玻片平放在玻片上，置37℃45分钟，取出玻片，流动的PBS洗15分钟。
５、显色
取底物液100ml于放有检样玻片染缸中，置室温。避光，30分钟。取出玻片，流动的去离子水洗15分钟，使其干燥。
６、镜检
   若左边触（涂）面中细胞浆呈棕黄色，细胞核无色，右边对照不显色者，则为阳性；否则为阴性。
７、认真观察病变。
II免疫荧光试验
一、目的
  掌握免疫荧光试验的方法及原理。
二、实验步骤
１、制片、固定同前法。
２、加染荧光抗体
在玻片左边的触（涂）面上滴2滴猪瘟荧光抗体液并涂开，右边用PBS作对照，将玻片平放在玻片架上，置37℃45分钟，其后PHS（PH7.4,0.01M）洗15分钟。
３、晾干玻片后，镜检。若左边触（涂）面中细胞浆呈特异性黄绿色荧光，右边对照不呈色者，则为阳性；否则为阴性。
III、示教实验
１、 ELISA试验检测猪瘟抗；
２、猪瘟病毒单克隆抗体的诊断应用；
３、感染猪瘟病毒PK-15细胞的IIF。
IV思考题
１、为什么要对触（涂）片进行固定？
２、为什么要灭活内源酶？机理是什么？
３、免疫酶组化法和常规ELISA有何异同点？优缺点是什么？
４、诊断猪瘟还可用哪些方法？
         实验五鸡新城疫的诊断
I、鸡新疫病毒的鸡胚分离
一、目的
掌握利用鸡胚分离病料中的NDV；
熟悉鸡胚接种方法。
二、实验器材
碘酒棉球、酒精棉球    锥子    蛋架    10ml灭菌管    1ml  、5ml吸管  玻璃研磨器    1ml注射器       5号针头          9-10龄鸡胚    生理盐水
青霉素双抗液（1万iu/ml）    离心机       天平    剪刀       镊子  玻璃
铅笔    ND病死鸡       透明胶布       照蛋器
三、实验动物的准备
将NDV强毒做1：100稀释注射健康的NDV易感小鸡（1月龄左右），0.2ml/只胸肌注射,小鸡将在注射后48小时左右死亡.死亡鸡尽快进行实验.
亦可从ND自然病鸡分离病毒.
四、实验步骤
１、无菌操作，沿死鸡颅腔边剪开颅骨，用镊子除去头盖骨，使脑髓暴露。
２、取约1g（蚕豆大小）脑髓置玻璃磨器内，并加少量生理盐水，磨碎，再补加生理盐水使总量约为5ml。然后加入双抗液0.5ml（最终浓度达1000iu/ml），置37℃作用20分钟，离心，2000转/分，15分钟。
３、取上清液接种鸡胚尿囊腔
（1）照蛋。在靠近气室的下方，避开大血管，用玻璃铅笔标记接种点。
（2）消毒。打孔。
（3）接种：将针头以与蛋壳成30（度）角的方向刺入尿囊腔，向尿囊腔内接种经步骤2处理的病料上清液0.1ml,注射速度宜慢.
（4）用透明胶布封口.
４、接种24小时开始照蛋，每天上、下午各照一次，弃去24小时内死亡的鸡胚，24小时以后死亡的鸡胚，置铁篓中，大头朝上，置4-8℃备做HA、HI试验。
５、观察死亡鸡的病变并做记录。
II、免疫荧光试验
一、目的
了解免疫技术的一般程序和荧光抗体的制备；
掌握利用抗NDV单克隆抗体和间接免疫荧光技术诊断ND的方法。
二、实验器材
抗NDV单抗    兔抗鼠荧光抗体       PH7.2 0.01MPBS 铜蓝    丙酮    蒸馏水       载玻片(洁净无油)       1000ml烧杯       磁棒    磁力搅拌器
滴管吸水纸剪刀    外科手术刀镊子病死鸡(新鲜)
三、实验动物的准备
同实验I
四、实验步骤
１、无菌操作，解剖鸡。
２、取脑、肺、脾和盲肠扁桃体，用切面在载玻片上作两个很薄的压印，自然干燥。
３、压印片置盛有4℃丙酮的染色缸内固定10分钟，取出自然蒸发干燥。
４、压印片置染色架上，一个压印面上加NDV单抗液数滴覆盖，另一个压印面上加PBS覆盖作对照，染色架置于37℃饱和水汽中（可置于水浴箱中）作用30分钟。
５、取出载玻片，用去离子水和蒸馏水漂洗后，置铜蓝中，流动PBS冲洗30分钟，15分钟换液一次，取出，吸水纸吸干并充分干燥。
６、将工作浓度稀释的兔抗鼠荧光抗体加于盖玻片的两个图片上，置37℃水浴作用30分钟。
７、流动的PBS冲洗30分钟，15分钟换液一次，自然干燥。
８、镜检
      凡组织胞浆内出现兰绿色荧光或荧光颗粒而细胞核无荧光的判为阳性，否则为阴性。
Ⅲ、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
一、目的
了解和HA和HI试验并用于诊断ND
二、实验器材
蛋架镊子滴管    10ml试管    微量血凝板    磨平滴管生理盐水    振荡器    大平皿    1ml吸管试管架    碘酒棉球 1%鸡红血球    NDV阳性抗血清搪瓷盘疑似ND病料接种致死的鸡胚（见实验I）
三、实验步骤
（一） HA、HI试验
１、无菌操作，收获鸡胚尿囊腔液。
２、作HA试验，测出血凝价。
３、作HI试验，测出血凝抑制价。
４、观察鸡胚病变，并做记录。
HA试验操作方法表解如下：
      试管号 1    2    3    4    5    6 7 8    9
      稀释倍数 1：10 2：10  1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 对照
试       生理盐水
      1:5稀释尿囊液
液 0.5%鸡红血球 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5    0.5
弃 0.5
   0.5
混匀,置室温20-30分钟观察结果
结果举例 # # # # # # ++ -- --
表1所示HA价为1:320
                              表2  HA-微量法(单位:滴)
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
生理盐水 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
尿囊原液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0.5%鸡红血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
                              混匀,置室温20-30分钟,观察结果
结果举例 # # # # # # # # # # # #
表2所示HA价为1:256
表3  HI-试管法(单位:ml)
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀释倍数 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 对照
尿囊液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃0.5
1:5稀释的抗NDV血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
                                 混匀,置室温30分钟
0.5%鸡红血球 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀置室温20-30分钟观察结果
结果举例 - - - - - + ++ # -
表3所示HI价为1:160
                           表4 HI-微量法(单位:滴)
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
尿囊液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 弃1
抗NDV血清 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀,置室温30分钟观察结果
0.5%鸡红血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀,置室温20-30分钟
结果举例 - - - - - - - + ++ +++ # -
表4所示HI价为1:128
注:若HA价是1:320,则0.5ml1：160稀释的尿囊液中含2iu病毒，0.5ml1:80稀释的尿囊液中含4iu病毒,0.5ml1:40稀释的尿囊液中含8iu病毒.
   HI试验用搞原直接稀释血清法,表3和表4中,第1管(孔)用0.5ml含水8个iu病毒的尿囊液,第2—4管(或2—12孔)用0.5ml含4个iu病毒的尿囊液.
四、思考题
１、什么叫血凝价（HA价）？什么叫血凝单位？什么叫血凝抑制价？
２、为什么诊断ND要做HI 试验？
３、 HA和HI试验在家畜传染病学上应用有哪些？
４、为什么NDV具有自动解凝现象？解凝后的红细胞能否再被NDV凝集？
５、如何判定HA和HI试验结果？
IV、示教试验
１、 NDV单抗分型试验（IIF）？
２、单抗夹心ELISA试验检测NDV。
      实验六       鸡马立克病的琼扩诊断
一、目的
掌握琼脂板的制作方法和利用双向琼扩试验诊断ND。
二、实验器材
干净大平皿打孔器    打孔图纸       16号针头    7号针头       磨平针头
剪刀    镊子       试管架    搪瓷盘       天平    铝锅       电炉    玻棒
10ml吸管    毛细滴管       滴头       红铅笔       橡皮膏    湿盒    阳性羽根
琼脂粉    氯化钠       量管    蒸馏水       示教平板
三、实验步骤
（一）琼脂板制备
１、  称取琼脂粉4g，NaCL  400g铝锅内加蒸馏水500ml，煮沸溶化。
２、浇琼脂板，每只直径90mm平皿倾注溶化的0.8%琼脂液18—20ml,然后将平皿置于水平的桌面上,使其自然凝固成厚度均匀的琼脂平板。
３、按试验的需要打孔，烫孔。
（二）羽根琼扩试验
１、按打孔图纸所示模式打孔，烫孔。
２、每只受检鸡拔取6根新羽（最好是羽根带血的新羽），剪下羽根，长约0.5ｃｍ。
３、在孔内加抗MD阳性血清。
４、距血清孔内约3mm的四周上均匀六点垂直插入同一只鸡的六根羽根，并做阳性羽根对照。在平皿壁上标记受检的号码。
５、平皿置湿盒中，于37℃进行扩散。
６、 24小时后观察结果，同一只鸡的六根羽根只要有一根与抗MD阳性血清孔间出现沉淀即可判定为MD阳性鸡。
（三）血清琼扩和羽根浸液琼扩试验
１、受检鸡血清分离
以带20号针头的1ml玻璃注射器从鸡翅静脉采血约0.5ml注入灭菌试管，也可以刺破静脉后，将一灭菌试管靠近流血处使血流流入试管约0.5ml，将试管摆成斜面，待血凝固，血清析出，供实验用。
２、羽根浸液的制备
将受检鸡新生羽根10条放在小试管内，加生理盐水约0.5ml，用玻璃棒轻压羽根，使囊内的MDV浸出，上清液供实验用。
３、按打孔图纸模式打孔、烫孔，共九个区。
４、实验程序
（1）血清琼扩
将MD诊断抗原液加入中间孔，受检鸡血清加入周围孔，每个检样用一孔，并设抗MD 阳性血清对照，每区最接近平皿壁的孔定为第1孔，由此按顺时针方向定为2、3、4、5、6孔，在记录本上记下与孔号相对应的鸡号。
（2）羽根浸液琼扩
将MD阳性血清加入中间孔，受检羽根浸液加周围孔，每个检样用一孔，并设阳性MD 抗原对照，记录鸡号的方法，同血清琼扩。
５、将平皿置湿清加入中，于37℃进行扩散。
６、 24小时后观察实验结果，出现沉淀线则为MD阳性鸡。
四、思考题
１、羽根琼扩和血清琼扩各适用于何种月龄的鸡的MD诊断？为什么？
２、血清琼扩在实际工作中还可用于哪些禽病的诊断？
３、用鸡血清进行琼扩试验，应用什么浓度NaCL 的琼脂板？
４、琼扩试验的原理是什么？
５、琼脂平板的保存应注意什么问题？
五、示教试验：MDV单抗分型鉴定（IIF）
   注：鸡传染性法氏囊病（IBD）的琼扩诊断是取待检鸡血清与传染性法氏囊病诊断抗原作琼扩试验，其原理和操作方法同MD 的血清琼扩试验。
         实验七沙门氏菌快速检验试验
一、目的
   了解沙门氏菌快速检验的方法和原理；
   掌握FA和ELISA的操作步骤
二实验器材
使用仪器、器械、试液，请参阅前述有关章节模拟待检样品
  三实验步骤
（一）直接免疫荧光试验检测沙门氏菌
１、取胜模拟样品增菌培养物10ml，于载玻片上涂成2cm（）面积的薄膜，空气干燥。
２、以4℃或-20丙酮固定涂膜，室温10—15分钟，晾干。
３、加染荧光抗体（FITC标记兔抗菌素沙门氏菌血清或O 抗菌素原单抗），37℃45分钟。
４、 PBS  PH7.4  0.01M搅拌下洗涤10分钟,晾干.
５、于荧光镜下镜检，阳性样品在细菌四周有特异性黄绿色荧光，而阴性样品未见黄绿色荧光。
（二）单抗夹心ELISA试验检测沙门氏菌
１、以方阵试验确定单抗包被浓度和酶标制剂的使用浓度。
２、以pH9.6碳酸盐缓冲液包被单抗，100ul/孔，4℃过夜，或37℃2hr。
３、PBST洗涤三次。
４、以10%CFS-PBS封闭37℃3hr。
５、PBST洗涤三次。
６、加模拟样品增菌液，100ul/孔,室温15分钟。
７、PBST洗涤三次。
８、加新配套OPD底物缓冲液，100ul/孔,室温15分钟。
９、2M HSO终止反应（100ul/孔）。
10、加新配OPP底物缓冲液，100ul/孔，室温15分钟。
11、2M H2SO4终止反应（100ul/孔）
12、肉眼判定或测定OD496值。
（三）示教试验沙门氏菌O-I噬菌体裂解试验。

         实验八  鸡白痢的诊断
一、目的
掌握快速全血平板凝集反应并用来诊断鸡白痢。
二、实验器材
小搪瓷盘铁丝环滴管玻璃板干净纱布    24号针头 7号针头    灭菌大平皿
生理盐水鸡白痢凝集抗原液
三、实验步骤
（一）快速全血平板凝集试验
１、将鸡白痢诊断抗原液充分振荡混匀，用滴管吸取抗原滴2滴于玻板上。
２、一人保定鸡，另一人用7号针头刺破被检鸡的翅静脉使其出血。
３、用铁丝环沾取一滴环血液与玻板上的抗原液搅拌均匀，并涂开至直径约1.5cm大小的涂面。
４、 25℃时，于2分钟内出现明显的凝集颗粒或凝集片则为阳性反应。
（二）示教实验
１、鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定；
２、间接血凝试验；
３、琼脂扩散沉淀试验；
４、抗体竞争ELISA试验。
注：鸡慢性呼吸道病的现场诊断是慢性呼吸病平板凝集抗原与受检全血做凝集试验。操作方法同鸡白痢的快速全血玻板凝集实验。