复方中药制剂“球宁”对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡血浆

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复方中药制剂“球宁”对感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡血浆 SOD、MDA含量的影响 张 铁1 王春光1 宫新城1 苑方重1 张国磊1 翟向和1 钟秀会2*    (1. 河北农业大学中兽医学院 河北定州 073000 2. 河北农业大学动物科技学院 河北保定 071000 *通讯作者）

摘要：用青蒿、常山等组成复方中药制剂“球宁”，并对其进行超微粉碎加工成微粉制剂。按不同比例添加于饲料中，饲喂人工感染柔嫩艾美耳球虫的雏鸡，以磺胺喹啉钠为对照，在感染后第8d剖杀，检测血浆中SOD、MDA的含量，结果表明，用药各组与阳性对照组相比均能增加雏鸡血浆SOD含量；降低血浆丙二醛（MDA）含量。说明所试中药可以增加机体清除自由基的能力，减少自由基对机体的损伤，从而保护机体。     关键词：中药；E.tenella；超微粉碎；SOD； MDA     鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道所引起的、最常见的一种原虫病，呈世界性分布。据Bhoal[1]报道，全世界抗球虫药的年消费是33亿美元。我国养鸡数为30亿～60亿羽，按郁明发[2]报道的每羽肉仔鸡平均耗用抗球虫药费为0.2～0.3元估算，我国每年用于鸡的抗球虫药费用达6亿～18亿元人民币。该病多发生于15～50日龄的雏鸡，发病率和死亡率均较高。集约化养鸡场则是球虫病暴发的最适宜场所，其发病率为50%～70%，严重时高达80%，给养鸡业带来严重的经济损失。     该病主要依靠化学药物进行防治，但球虫耐药性问题给临床防治带来很大麻烦[3]。中药具有毒副作用小和抑杀球虫、增强鸡体免疫功能及促生长等特点，尤其是鸡球虫对其不易产生耐药性，因而有广阔的发展前景。将中药进行超微粉碎后，药物的吸收率大大提高，减少剂量，可明显提高制剂的药效学活性[4]，节省原料，提高效率，降低成本。     近年来，自由基在生物体系中的作用已成为生命科学的研究热点之一。体内产生的自由基以氧自由基（Oxygen Free Radicals, OFR）为主，约占95%，对机体危害亦最大。在正常的生理状况下，生物体内的自由基不断产生，也不断被清除，维持在低水平的平衡浓度。少量的自由基对机体是有益的，但过量的自由基可对机体造成损伤，是构成很多疾病的病理学基础。有资料证明，球虫感染后，鸡体内的氧自由基生成反应加剧，说明氧自由基参与了球虫的致病过程[5，6，7]。     本试验中用青蒿、常山等组成复方中药制剂“球宁”，并对其进行超微粉碎加工成微粉制剂，按不同比例添加于饲料中，饲喂人工感染柔嫩艾美耳球虫的雏鸡，分别检测血浆中MDA、SOD的含量。初步探讨球虫感染和抗球虫中药对机体氧自由基变化的关系，进一步阐明中药抗球虫机理和为新型抗球虫药物的研制提供依据。     1 材料与方法     1.1 试验动物购自定州市二贤种鸡场的1日龄海兰灰蛋公雏。购进后于无球虫的消毒铁丝笼内隔离饲养至23日龄，经粪便检查，确认无球虫感染后作为试验用鸡。     1.2 球虫卵囊     试验用柔嫩艾美耳（E.tenella）卵囊由中国农业大学动物医学院寄生虫室惠赠。孢子化后，用15日龄小雏鸡复壮，再经孢子化后，记数，备用。     1.3主要试剂与药品     试验所用中药（青蒿、常山、鸦胆子、硫磺粉、地锦草、仙鹤草、金鸡纳、党参、甘草）购于定州市时代药房；丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物试剂公司，批号：20040227)，超氧化物歧化酶(SOD) 测定试剂盒(南京建成生物试剂公司，批号：20040227)。     1.4主要仪器设备     普通中药粉碎机；倍力BMF-6型超微粉碎机（济南倍力粉工程技术有限公司）；UV-9100分光光度计（上海第三分析仪器厂）。     1.5 试验方法     1.5.1药物的制备     将青蒿、常山、鸦胆子、硫磺粉、地锦草、仙鹤草、金鸡纳、甘草8味中药按一定配比组成复方后，分别经普通粉碎机和超微粉碎机加工粉碎后备用。     普通粉（即粗粉）要求：全部药物通过80目筛（筛孔直径177微米）。超微粉碎（即微粉）要求：全部药物通过625目筛（筛孔直径20微米）。     1.5.2试验设计     从经预备期饲养至23日龄的雏鸡中选取健康雏鸡115只，随机分为7组，每组15只，称量记录体重。分别为不感染不给药阴性对照组；感染不给药阳性对照组；感染给西药组（磺胺喹啉钠，饮水浓度100ppm）；感染给中药普通粉碎（2%添加）组；感染给中药微粉（2%添加）组；感染给中药微粉（1%添加）组；感染给中药微粉（0.5%添加）组。并于分组后的次日每组分别经口感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊4.0×104个/只，常规饲养，当攻虫组出现第一堆血便时，开始添加药物。     1.5.3 盲肠组织病理学检查     盲肠组织经波恩液（25%的福尔马林+75%饱和苦味酸饱和溶液）固定48h→70%酒精（2h）→80%酒精（2h）→85%酒精(2h)→90%酒精(2h)→95%酒精(2h)→100%酒精Ⅰ(1h)→100%酒精Ⅱ(1h)→(二甲苯与乙醇的等比溶液)30min→二甲苯20min→二甲苯20min→石蜡Ⅰ30min→石蜡Ⅱ30min→石蜡Ⅲ20min→连续切片4μm，隔3取1，进行HE染色，中性树胶封固，显微镜下观察病理组织变化。     1.5.4 血浆超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA含量的测定     1.5.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）的测定     采用黄嘌呤氧化酶法，通过黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2—），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计测定其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过计算可求出被测样品中的SOD含量。     各组分别于感染后第8d，采血分离血浆，然后按试剂盒所示步骤进行。     1.5.4.2 丙二醛（MDA）的测定     硫代巴比妥酸（TBA）法，过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。用可见分光光度计测定其吸光度。通过计算MDA含量。     各组分别于感染后第8d，采血分离血浆，然后按试剂盒所示步骤进行操作。     1.5.5 抗球虫指数（ACI）的测定[8]     分别计算用药各组的增重率、存活率、病变值和卵囊值。     抗球虫指数（ACI）=（增重率+存活率）—（病变值+卵囊值）     2 结果     2.1盲肠组织病理学变化     感染后4～7d，是病变最严重的阶段。主要表现为：中、后段盲肠粘膜深层严重出血，大量粘膜上皮脱落，严重者可见整个粘膜几乎完全脱落，肠腺破坏，其表面被覆大量脱落的变性、坏死的上皮细胞和红细胞，以及许多大型第2代裂殖体。粘膜下层显著充血、水肿及淋巴细胞与嗜酸粒细胞浸润，小血管壁发生纤维素样变，肌层亦有少量淋巴细胞和嗜酸粒细胞浸润，浆膜下小血管充血或出血。未脱落粘膜的固有膜中，聚集有许多大型第2代裂殖体，含有许多香蕉形裂殖子，虫体周围有淋巴细胞、嗜酸粒细胞浸润。     感染后6d，可见肠腺上皮中寄生有配子体，成熟大、小配子体寄生于绒毛上皮和肠腺上皮中，有时可见肠腺完全为配子体占据。     用药组中以微粉组（2%）、粗粉组（2%）、微粉组（1%）病变最为轻微，微粉组（0.5%）、西药组较为严重。     2.2 各组药物的抗球虫指数（ACI）     通过公式计算用药各组的ACI，以微粉组（2%）最高为193.73，粗粉组（2%）和微粉组（1%）接近分别为181.64和182.78，微粉组（0.5%）为152.35，西药组最低为128.92。     2.3各组药物对感染E.tenella球虫雏鸡血浆超氧化物歧化酶（SOD）含量的影响     感染球虫的各组在感染的第8d时，用药各组与阳性对照组相比均能增加雏鸡血浆SOD含量，其中微粉组（1%）、粗粉组（2%）、微粉组（2%）三组与阳性对照组差异极显著（p<0.01）；与阴性对照组差异显著（p<0.05）；微粉组（1%）与粗粉组（2%）两组之间差异不显著；微粉组（0.5%）、西药组两组与阳性对照组差异显著（p<0.05）；两组之间差异不显著。结果见表1。 表1 血浆SOD含量检测结果（NU/ml） 试验组 各组平均数 差异显著（p<0.05） 差异极显著（p<0.01） 阳性对照组 155.8±4.6 a A 微粉组（0.5%） 158.3±5.1 b A 西药组 158.6±5.6 b A 粗粉组（2%） 165.8±8.3 c B 微粉组（1%） 167.5±6.9 cd B 微粉组（2%） 169.4±6.6 d BC 阴性对照组 172.5±9.3 e C        注：含有不同小写字母者差异显著（p<0.05），含有不同大写字母者，差异极显著（p<0.01）。下同     2.4 各组药物对感染E.tenella球虫雏鸡血浆丙二醛（MDA）含量的影响     感染球虫的各组在感染的第8d时，用药各组血浆丙二醛（MDA）含量与阳性对照组相比均有所降低，其中粗粉组（2%）、微粉组（2%）两组与阳性对照组差异极显著（p<0.01）；微粉组（2%）与阴性对照组差异不显著；微粉组（1%）与粗粉组（2%）两组之间差异不显著。西药组与阳性对照组差异不显著。结果见表2。 表2 血浆MDA含量检测结果（umol/ml） 试验组 各组平均数 差异显著（p<0.05） 差异极显著（p<0.01） 阴性对照组 2.73±0.18 a A 微粉组（2%） 2.89±0.19 ab A 粗粉组（2%） 3.07±0.25 b A 微粉组（1%） 3.19±0.28 bc AB 微粉组（0.5%） 4.04±0.29 c B 西药组 4.12±0.42 cd B 阳性对照组 4.74±0.43 d B     3 讨论     在生理情况下，体内氧自由基（Oxygen Free Radicals, OFR）浓度极低并处于平衡状态，不仅对机体无害，还有独特的生理作用，如有助于吞噬细胞杀灭有害的微生物等[9,10]。在疾病的情况下，机体体内氧自由基产生过多或机体清除OFR能力减弱，则可产生丙二醛（MDA）等，对机体有较强的毒性作用，致使组织损伤而发生疾病[11,12] 。另外，OFR通过引发脂质过氧化、损伤蛋白质、核酸等生物大分子物质以及其它方式，造成组织细胞损伤，影响机体内环境的相对稳定，从而促进疾病的发生与发展[13,14]。     大量资料表明，生物体内OFR虽然不断地产生，但也不断地被清除。氧自由基的清除涉及的酶有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）等[15，16，17]。     因此SOD含量的高低间接反映机体清除自由基的能力，MDA含量的高低间接反映机体受氧自由基攻击的严重程度。     试验中阳性对照组与阴性对照组比较，血浆SOD含量和血浆MDA含量均为差异极显著（p<0.01），说明鸡在感染E.tenella过程中机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如MDA等以及新的氧自由基，引起细胞损伤。结果与郑明学[6]，聂奎[7]报道的结果一致。     本试验中感染球虫的各组在感染的第8d时，用药各组与阳性对照组相比均能增加雏鸡血浆SOD含量，降低血浆丙二醛（MDA）含量。具体的作用机理可能是方中含有抗球虫的中药常山、青蒿等，药物通过抑制球虫在鸡体内的增殖，从而保护机体清除自由基的能力，减少自由基对机体的损伤，降低球虫感染过程对机体的致病作用，进而保护机体；另外试验方剂中含有地锦草，据曹瑞珍[18]报道，地锦草提取物可明显提高小鼠血液SOD活性，降低MDA含量。     通过盲肠组织病理切片和各组药物的抗球虫指数分析，用药组中以微粉组（2%）盲肠病变最为轻微，抗球虫指数（193.73）最高，雏鸡血浆SOD含量最高，而血浆丙二醛（MDA）含量最低；西药组盲肠病变最为严重，抗球虫指数（128.92）最低，雏鸡血浆SOD含量最低，血浆丙二醛（MDA）含量最高。因此可见盲肠病变与血浆SOD含量呈负相关，与血浆丙二醛（MDA）含量成正相关。     综合分析试验各组的盲肠病变、抗球虫指数、雏鸡血浆SOD、MDA含量等指标，粗粉组（2%）和微粉组（1%）差异均不显著。所以从添加剂量考虑，以微粉组（1%）为最经济、最合理的添加剂量，证明中药超微粉碎可以减少添加量，只为粗粉用药量的1/2。