嘌呤法测定瘤胃微生物蛋白

huig5182005

瘤胃微生物蛋白质产量的测定

嘌呤法

一、操作方法样本的嘌呤分析

1、准确称取0.5克充分干燥（用冻干机干燥）的食糜样本，或分离所得的食糜微生物部分样本，置于25ml具塞带刻度的试管内。注意：样本必须是干燥的，否则会导致核酸水解不完全。

2、加入2.5ml高氯酸(Hclo4,70%)，紧盖瓶口，然后将其放在90~95℃的恒温水浴内培养1小时。此时样本即炭化，形成黑色硬结。最好是将硬结破碎，以利反应完全。

3、再加入17.5ml乙种PH缓冲液(NH4H2PO4,0.0285M)，充分摇动，紧盖瓶口，重新置于90~95℃的恒温水浴内培养10~15分钟，然后通过Whatman 4号滤纸过滤，此时滤液的PH值为2左右。

4、取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内。分别加入0.5ml AgNO3(0.4M)和9ml甲种PH缓冲液(NH4H2PO4,0.2M)。然后置于暗处至少30分钟。最好是将其放置过夜(5℃)，可提高分析的准确度。

5、于4000rpm离心15分钟，然后小心地弃去上清液。注意不要搅动瓶底的沉淀物。

6、用PH为2的蒸馏水洗离心分离所得沉淀物一次。用与第5步同样的方法离心，弃去上清液。

7、加入10ml 0.5N的盐酸溶液，充分摇动，使其与沉淀物混匀为止。

8、用具塞密封离心管，放在90~95℃的恒温水浴内培养30分钟。

9、用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示。

酵母RNA（中国科学院上海生物化学研究所）

标准曲线的制定：准确称取0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.4,0.50克酵母RNA，分别置于8个25ml的具塞带刻度的试管内，按上述分析样本内嘌呤含量的操作方法进行处理，最后于260nm处比色。