欧洲型PRRSV RT­PCR检测方法的建立及ORF7基因序列比较____腾骏药业

kinki0396

摘　要：根据PRRSV(LV株)ORF7基因设计一对引物，建立了欧洲型PRRSV的RT PCR检测方法。通过对50份组织病料检测及其ORF7基因序列分析，结果表明，有4份组织病料扩增出欧洲型PRRSV 576 bp特异性片段，阳性率为8%，其ORF7基因序列和氨基酸推导序列与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMERVAC PRRS)的同源性分别在99.0%～99.7%和98.5%～100%之间，而与标准毒株(LV)的同源性分别在95.9%～96.6%和96.9%～97.7%之间。表明该PT PCR体系适合组织病料中欧洲型PRRSV的直接检测，同时也证实了欧洲型PRRSV在我国的存在，并且与疫苗株之间具有较高的同源性。
关键词：欧洲型猪繁殖与呼吸综合征；逆转录
聚合酶链反应；ORF7基因  
PRRSV属尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)成员，为一种有囊膜单股正链RNA病毒，是引起猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)的主要病原。1991年荷兰科学家从患有母猪繁殖障碍症状的病猪中分离到PRRSV[1]，郭宝清等也成功分离出PRRSV[2]。目前，根据PRRSV的不同来源地及其核苷酸序列的差异，将其分为美洲型与欧洲型[3]。已建立了美洲型PRRSV的RT PCR检测方法[4 7]，但针对欧洲型PRRSV的检测少见报道。
PRRSV基因组不分节段，大小为15 kb左右，含有8个开放阅读框(ORFs)，ORF2 7编码其结构蛋白，其中ORF7基因(大小为387 bp)编码核衣壳蛋白(N)[3]，该蛋白具有强免疫原性，可作为PRRSV血清学诊断中首选的抗原蛋白[8]，在研究该病毒中具有重要的意义。本研究旨在建立组织病料中欧洲型PRRSV的RT PCR直接检测方法，并通过欧洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMERVAC PRRS)与临床样品中ORF7基因序列比较，进一步了解浙江省PRRSV流行情况。
1　材料与方法
1.1　PRRSV疫苗毒株
欧洲型PRRSV疫苗毒株AMERVAC PRRS(批号：2G0C 2)(简称PRRSV EU)，杭州市畜牧兽医局惠赠，主要用于RT PCR体系的建立和阳性对照。
1.2　临床组织病料的采集与保存
采集浙江省宁波地区养猪场不同疑似PMWS猪的肺、肝、脾、扁桃体和淋巴结等组织，共50份。置－20 ℃冷冻保存备用。
1.3　主要试剂
反转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、Taq DNA polymerase均购自北京鼎国生物技术中心；dNTP Mix购自上海申能博彩生物科技有限公司；总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.4　引物设计与合成
根据GenBank中PRRSV标准毒株(LV)ORF7基因序列(参考序列为M96262)设计了一对引物，可扩增出约576 bp的基因片段，其中包括完整的ORF7基因。以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列为：上游N eu(20 bp) GAGCATACGCTGTGAGAAAG；下游N(21 bp)：TCGCCCTAATTGAATAGGTGA。
1.5　PRRSV EU以及组织病料中总RNA的提取
分别取匀浆组织病料2 g和PRRSV EU 1 mL，反复冻融3次。12 000 r/min离心16 min，取300 μL上清液，用Trizol RNA试剂盒提取总RNA，备用。
1.6　RT PCR
1.6.1　反转录(RT)　在1.5 mL离心管中分别加入9 μL总RNA,1 μL下游引物N和0.5 μL RNase抑制剂；65 ℃加热10 min，
迅速置冰上10 min；按顺序加入以下试剂：4 μL 5×RT 缓冲液，0.5
μL RNase抑制剂，2
μL DTT,2 μL dNTP,1 μL反转录酶；42 ℃孵育1 h；90 ℃作用5 min。
1.6.2　PCR　PCR反应总体积为30 μL，其中双蒸水20.4 μL,10×buffer 3 μL，dNTP 0.6μL，上游引物N eu 1.6 μL，下游引物N 0.6 μL，cDNA模板3 μL，Taq DNA polymerase 0.8 μL。按下列程序进行PCR反应：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,61 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,25个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳。
1.7　ORF7测序及同源性比较
分别将PRRSV EU、组织病料的PCR扩增产物割胶回收，分别通过T A克隆、测序获得ORF7基因序列。采用DNA Star软件对ORF7序列进行比较。
2　结果
2.1　欧洲型PRRSV核酸的特异性RT PCR检测
应用上述引物和反应体系，对PRRSV EU、美洲型PRRSV疫苗毒株、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒进行RT PCR或PCR扩增，结果仅欧洲型PRRSV疫苗毒株能扩增出约576 bp的特异性片段(图1)，与预期结果相符。而其他病毒无任何扩增片段。
2.2　RT PCR检测组织样品
所建立的RT PCR体系用于50份组织样品的检测，其中4份可扩增出预期的576 bp的特异性片段(图2)。检测为阳性的组织样品分别命名为N 34、N 42、N 45、N 57。

  

M.DNA标准DL 2 000；1.PRRSV EU；2.美洲型PRRSV疫苗毒株；3.猪瘟病毒；4.猪伪狂犬病病毒；5.猪细小病毒；6.猪圆环病毒；7.阴性对照
M.DNA Marker DL2 000；1.PRRSV EU；2.PRRSV American type vaccine strain；3.CSFV；4.PRV；5.PPV；6.PCV；7.Negative control

图1　欧洲型PRRSV核酸的特异性RT PCR检测

Fig.1　Specificity of RT PCR detection of European type PRRSV nucleotide

  

  

M.DNA标准DL 2 000；1～4.PRRSV欧洲型阳性(4/50)； 5.阴性对照
M.DNA Marker DL2 000；1 4.Positive European type PRRSV
(4/50)；5.Negative control

图2　RT PCR检测组织样品

Fig.2　Detection of tissue samples by RT PCR

2.3　ORF7基因同源性比较
基因序列和氨基酸推导序列比较(表1)，结果表明，4份阳性组织病料与PRRSV EU的ORF7基因序列及推导的氨基酸同源性分别在99.0%～99.7%和98.5%～100%之间，而与LV参考毒株(M96262)的ORF7基因序列及推导的氨基酸同源性分别在95.9%～96.6%和96.9%～97.7%之间。由此推知，4份阳性组织病料中欧洲型PRRSV与PRRSV EU亲缘关系较近，而与LV参考毒株(M96262)亲缘关系较远。测序结果表明(图3)，

  

表1　PRRSV欧洲型部分核苷酸序列(上侧)及推导氨基酸序列(下侧)同源性比较

Table 1　Percentage of
European type PRRSV
nucleotide sequence homology(upper diagonal) and percentage of European type PRRSV amino acid sequence homology(lower diagonal)

Nucleotide amino	PRRSV EU	N 34	N 42	N 45	N 57	M96262
PRRSV EU		99.7	99.7	99.5	99.0	96.4
N 34	100.0		100.0	99.7	99.2	96.6
N 42	100.0	100.0		99.7	99.2	96.6
N 45	99.2	99.2	99.2		99.5	96.4
N 57	98.5	98.5	98.5	99.2		95.9
M96262	97.7	97.7	97.7	96.9	96.2

图3　ORF7基因的序列比较

Fig.3　Sequencing and analysis of the ORF 7 gene  

N 34、N 42与PRRSV EU相比较，对应的碱基突变位点为第255位；N 45与PRRSV EU相比较，对应的碱基突变位点为第113位和第255位；N 57与PRRSV EU相比较，对应的碱基突变位点为第19位、第113位、第189位和第255位。
3　讨论
自1996年以来，我国规模化养猪场大多经历了由PRRSV引起的“流产风暴”，表现为妊娠母猪的晚期流产、产弱仔、产死胎和木乃伊胎，哺乳仔猪和保育仔猪的死亡率高，造成了极大的经济损失[9]。之后，我国有很多猪场开始使用PRRSV弱毒活疫苗，目前仅有勃林格生产的美洲型PRRSV毒株弱毒活疫苗在我国农业部正式注册使用，但Hipra Laboratories生产欧洲型PRRSV毒株弱毒活疫苗也在我国部分猪场使用。PRRSV弱毒疫苗的安全性还存在争议。研究表明，在选择性压力的作用下，弱毒疫苗毒株会发生返祖现象，变为强毒株，从而造成PRRS的暴发[10]。1996年，丹麦经PRRS弱毒疫苗免疫的猪群暴发PRRS证实了这一点[10]。用RT PCR方法对丹麦某猪场的组织病料进行检测，通过对病毒核苷酸序列ORF2 ORF7的分析发现，其序列与VR2332序列的同源性在99.2%～99.5%之间，而VR 2332株为丹麦所使用的弱毒苗的祖代毒株[11]。因此，流行于丹麦的美洲型PRRSV可能与美洲型弱毒疫苗株的散播和毒力返祖有关。尽管我国还未见欧洲型PRRSV分离株的报道，但从本研究检测的结果分析，在我国一些地区的猪场可能已存在欧洲型PRRSV，但关于它的来源及其扩散和感染性有待进一步深入研究。
本研究在建立欧洲型PRRSV的RT PCR检测方法的基础上，测序分析欧洲型PRRSV浙江毒株ORF7基因，分析结果表明，组织病料中4份欧洲型PRRSV毒株与欧洲型PRRSV疫苗株(AMERVAC PRRS)的核酸序列具有高度同源性(99.0%～99.7%)，推测病料中检测出的欧洲型PRRSV可能来源于欧洲型PRRSV疫苗株。但从组织病料中检测出的欧洲型PRRSV毒株是否为强毒株？目前浙江省内有无该欧洲型PRRSV强毒株流行？都有待于进一步的研究。