应用PCR技术诊断猪圆环病毒2型与猪伪狂犬病病毒混合感染＿＿＿陈义祥等

kinki0396 · 发表于 2007-8-1 09:05:21

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV-2）是从猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）病猪中分离的猪圆环病毒，又称PMWS相关PCV。一般由PCV-2单独引起的疾病比较轻微，但常常由于并发或继发细菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可达25%以上。PCV-2感染和引起的疾病已呈全球分布，已成为危害养猪生产的主要疾病之一。我国北京、上海、江苏等地都已证实有该病毒的存在，PCV-2具有免疫抑制特性，PCV-2感染可以引起继发性免疫缺陷，发病或感染猪至少有短暂的免疫抑制现象而不能激发对其他病原体的有效免疫应答。猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）又称猪疱疹病毒Ⅰ型，可引起家畜和某些野生动物的传染病，其中对猪的危害最大，主要特征是发热和脑脊髓炎，新生仔猪出现神经症状，成年猪多为隐性感染，妊娠母猪表现为流产、死胎、木乃伊，尤其是以产死胎较为严重，目前已有40多个国家报道发生本病，每年给世界养猪业造成巨大的损失，PRV已在我国广泛存在。目前，关于PCV-2和PRV病原学常规检测方法常常存在特异性、敏感性差、操作技术复杂、费时费力等缺点。PCR方法具有快速、特异、敏感的特点，已广泛用于许多病毒和细菌病的快速诊断，PCV -2和PRV的分子生物学方面的研究已取得了很大的进展。本试验在结合流行病学、临床症状、病理剖检的基础上，应用PCR技术将桂林市和贵港市两地送检的病料，快速、准确地诊断为PCV-2和PRV的混合感染。
1 材料与方法
1．1 病料处理 5月22日与8月10日，从广西自治区桂林市和贵港市两大规模化猪场无菌采取发病猪的脾脏、淋巴结、脑，-20℃保存。
1．2 主要试剂 SDS购自AMRESCO、Tris 饱和酚购自TBD.BIO；氯仿、无水乙醇购自上海；dNTPs、TaqDNA聚合酶购自MBI公司；DL2000 DNA Marker、蛋白酶K购自TaKaRa公司。
1．3 引物合成参考芦银华根据PCV-2全基因序列设计引物，C1：5′-CCG CGG GCT GGC TGA ACT T-3′； C2：5′-ACC CCC GCC ACC GCT ACC-3′预期扩增的片段长度为1154 bp。参考中华人民共和国猪伪狂犬病诊断技术标准，引物序列为：PR1：5′-CAG GAG GAC GAG CTG GGG CT-3′； PR2：5′-GTC CAC GCC CCG CTT GAA GCT-3′，扩增猪伪狂犬病病毒基因中434~651碱基对（bp）之间217 bp片段。以上两对引物均由大连宝生物公司合成。
1．4 病料中总DNA的抽提分别取病猪脾脏、淋巴结及脑，用研磨器充分研磨，用Hank's液1∶5稀释，反复冻融3次以上，8 000 r/min离心10 min，取上清500 μl，加30 μl 10% SDS和10 μl 20 mg/ml蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2 h。加入等量的饱和酚，12 000 r/min离心5 min。取上清液，加入等量的酚∶氯仿（1∶1），涡旋20 s，12 000 r/min离心5 min。取上清液，加入等量的氯仿，振荡混匀，12 000 r/min 离心5 min。取上清液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10上清液体积的3 M NaAc(pH5.2)，使其混匀。-20℃放置60 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，用75%无水乙醇冲洗沉淀2次，晾干，加入20 μl双蒸水溶解即为模板。
1．5 PCV2目的基因片段的扩增 PCR反应体系：10×PCR buffer 5.0 μl，dNTP(2.5 m
mol/L) 4.0 μl，MgCl2(25 mmol/L) 3.0 μl，上下游引物(25 pmol/μl)各1.0 μl，cDNA 5.0 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl) 0.5 μl，加H2O至50 μl。预变性94℃ 10 min进入循环，94℃ 1 min，53℃ 1 min, 72℃ 1.5 min，35个循环后72℃延伸5 min。反应结束后取5 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察目的片段。
1．6 PRV目的基因片段的扩增 PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μl，MgCl2(25 mmol/L) 2.0 μl，PR1和PR2(25 pmol/μl)各0.5 μL，cDNA 4.0 μl，0.25 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，加H2O至25 μl。预变性94℃ 3 min进入循环，94℃ 1 min，65℃ 1 min,72℃ 1 min, 40个循环后72℃延伸5 min。反应结束后取5 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察目的片段。
2 结果 
2．1 PCV-2的检测结果应用PCR技术，利用合成的PCV2特异性引物，从两头病猪的
脾、淋巴结混合病料中均扩增出长度为1 154 bp的特异目的基因片段，与阳性对照扩增的片段大小一致（图1）。
图1 PCV2目的基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
1.桂林病料；2.贵港病料；3.标准PCV2；4.DL2000 DNA Marker
2．2 PRV的PCR检测结果应用PCR技术，利用诊断PRV特异性引物，分别从病猪的脑组织中扩增出了长度约217 bp目的基因片段，与预期的结果一致，表明所检测的病料为PRV阳性。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果（图2）。
图2 PRV目的基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
1.桂林病料；2.贵港病料；3.标准PCV；4.DL2000 DNA Marker
3 讨论 
3.1 近年来，关于PCV2和PRV的诊断方法有病毒分离鉴定、ELISA以及IFA等常规技术，随着分子生物学技术的发展国内外已经建立了聚合酶链式反应（PCR）诊断技术，PCR技术用于诊断PCV2和PRV具有：速度快、特异性强、敏感性高、稳定性好等特点，大大的提高了这两种病毒病的检出率和准确性，另外PCR技术对于PCV2和PRV的早期感染、潜伏期感染和持续性感染的诊断均具有重要的意义。
3．2 根据流行病学、临床症状、病理剖检的初步诊断，应用PCR技术，从广西桂林某规模
猪场的病料中同时扩增出PCV-2和PRV特异的目的基因片段，从而确诊为PCV2和PRV混合感染。目前，本实验室已经从广西区的许多地市检测并分离到PCV2和PRV，而这次是从猪体内同时检测到PCV-2和PRV的混合感染，可见疾病的发展情况日趋复杂，在疾病的预防和诊断过程中应引起重视。
3．3 控制和消灭猪伪狂犬病所面临的主要困难是伪狂犬病的潜伏感染问题，感染猪康复后往往会长期带毒，且有散毒的危险，在机体受到体内外因素的剌激时，病毒往往被活化，并由带毒动物传给其他动物，引起疾病暴发。所以要控制本病的发生，只有做好免疫接种，完善饲养管理，严格防止病毒传入健康猪群，尤其是引进种猪时必须经检验无病后才能引进。
3．4 根据近年来欧美各国在控制PMWS的经验表明，对PCV-2感染的特异性控制措施很难奏效，目前，还没有有效的疫苗可以用来预防PCV-2的感染。因此，只有通过对猪群加强饲养管理，提高营养水平，降低应激因素，完善用药方案，防止继发性感染，作好其他疾病的免疫接种等措施来预防和控制PCV-2的感染。

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vetxy · 发表于 2007-8-2 02:30:04

坚决反对用PCR作为诊断PCV2的依据。
之前的帖子已经有讨论了，这里不再鳌述原因了。

朱良 · 发表于 2007-8-30 17:25:39

还是不要用PCR作为诊断PCV－２的依据。
同意楼上的观点！

猪爪爬天下 · 发表于 2007-9-8 08:37:53

真是郁闷啊,不是看不懂,是看懂了感到害怕.