内切木聚糖酶的检测方法

玫香 · 发表于 2007-7-13 14:36:58

最近,看了一些木聚糖酶的资料,关于内切和外切不同的厂家说法不一,附件中为一家公司化验方法,可能由于来源\底物和化验方法的不同,检测结果差异很大,困惑中.......

fjcwr · 发表于 2007-7-14 23:29:29

木聚糖酶的测定方法
1 原理
内切-(1,4)-b-D-木聚糖酶将蓝铜矿胶连染色的小麦阿拉伯木聚糖底物分解，产生水溶性染色片断。这些片断的释放速率（590nm条件下的吸光度值的增加）可以直接反应木聚糖酶的活性。
2 试剂
2.1 Xylazyme AX药片（Megazyme，澳大利亚）
2.2 饲料标准木聚糖酶
通过FFI DNS方法进行测定的标准木聚糖酶储备液
2.3 0.2mol/l的醋酸缓冲液，pH 4.2
将12g的冰醋酸加到900ml的蒸馏水中，用氢氧化钠调节pH值至4.2，用蒸馏水定容至1L。
2.4 2%的Trizma溶液（2％）
将20g的Trizma（Sigma，T-1503）溶解至900ml的蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至1L，此溶液不需要调整pH值。
2.5 标准木聚糖酶工作液
将标准木聚糖酶储备液（2.2）加入蒸馏水稀释，直至最后溶液中木聚糖酶的活性大约在50U/ml。这种溶液不很稳定，因此需要在分析前进行配制。
3 分析方法
3.1 酶的提取
已知添加量的方法
3.1.1 取5只试管，其中4只试管中添加1g左右的饲料样品（样品的粉碎粒度应小于1mm），另外一只试管中加入已知活性的酶样品溶液。另外要进行重复实验。
3.1.2 按照以下浓度的标准木聚糖酶工作液（2.5）加入到饲料样品中：
a) 空白（没有添加）
b) 1U/g
c) 2U/g
d) 3U/g
3.1.3 将一定数量的醋酸缓冲液（2.3）加入到饲料样品中，使其总体积达到10ml，在室温的条件下摇动试管10min。
3.1.4 在3500 rpm条件下离心10min。
标准曲线方法
在这种方法中，标准曲线在1周之内可以使用。但是如果样品中含有干扰成分，则测定的方法受到影响。
3.1.1b 建立标准曲线，通过在1g不含有酶制剂的“控制日粮”中添加已知浓度的标准木聚糖酶工作液。这种方法应该采用不同的日粮进行重复。
3.1.2b 称取1g饲料和1g参照饲料到离心管中，样品的粉碎粒度应小于1mm。另外要进行重复实验。
3.1.3b将10ml的醋酸缓冲液（2.3）加入到饲料样品中，在室温的条件下摇动试管10min。
3.1.4 在3500 rpm条件下离心10min。
3.2 分析方法
3.2.1 吸取0.1ml的上清液加入到试管中，试管中含有0.4ml的醋酸缓冲液（2.3），混匀。另外一个试管中加入0.5ml的醋酸缓冲液作为对照组。
3.2.2 在每个试管中加入一个Xylazyme AX药片（2.1），在50℃条件下反应1h，反应期间不需要搅动。
3.2.3 加入5ml的Trizma溶液（2.4）停止反应，在涡旋振荡器上振荡。
3.2.4在室温下放置5min，然后振荡一次。
3.2.5 在4500的条件下离心5min。
3.2.6用空白溶液作为空白，在590nm的条件下测定溶液的吸光度值。
4 结果计算
4.1a 已知添加量方法
计算所有重复的平均吸光度值。每个饲料样品可以根据4个吸光度值计算出一个回归曲线，Y轴为溶液的吸光度值，X轴为酶的活性，直线的斜率“S”和在Y轴上的截距“I”也可以计算求出。
饲料样品中的木聚糖酶的活性可以根据以下的公式计算出来：
木聚糖酶的活性（U/kg）＝I/S×1000
4.1b 标准曲线方法
计算所有重复的平均吸光度值。每个饲料样品可以根据4个吸光度值计算出一个回归曲线，X轴为吸光度值，Y轴为溶液中酶的活性。
直线的斜率“S”和在Y轴上的截距“I”也可以计算求出。
计算样品的平均吸光度值，木聚糖酶的活性按照以下的公式计算：
木聚糖酶活性（U/kg）＝（A×S＋I）/W×1000
A：样品的平均吸光度值
S：标准曲线的斜率
I：标准曲线的截距
W：样品的重量