动物基因工程

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  动物基因工程

一、遗传工程的概念

遗传工程（genetic engineering）是七十年代发展起来的一门新技术，它是综合分子生物学与微生物学、分子遗传学等理论和技术建立起来的。

1. 定义

广义：基因工程、细胞工程、染色体工程和细胞器工程。

狭义：基因工程

●基因工程：是一种操作，它不是通过一般传统的有性杂交方法，而是采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组转移到另一种生物中去，使后者定向地获得新的遗传性状，成为新的类型。这实际上就是目前讲的转基因技术。

2. 基因工程的优越性
传统杂交只能进行亲缘关系较近的交配（远缘交配失败），无法进行远缘交配（即遗传物质交流），遗传物质交流开始是全方位的，通过人为选择，可以达到目的性状，但工作量大，且容易改变原来的其他优良性状。但基因工程就不同的，它不但可以进行种间、属间科间遗传物质交流，还可以进行高等、低等，动物与植物间遗传物质交流，同时可以定向而不改变原来的优良性状，所以十分诱人！目前基因工程主要在以下几方面应用：


a. 生物制药

b. 遗传病治疗

c. 农业新品种选育

d. 发酵工程

e. 治理环境污染(创新微生物类型)

f. 其他
等

3. 基因工程施工的程序

a. 施工准备材料, 即“目的”基因，载体和工具酶等。

b. 把目的基因与载体结合成重组DNA分子


c. 把重组DNA分子引入受体细胞，即基因转移，建立分子无性繁殖或称克隆。
    d. 鉴定筛选转基因系
  二、基因工程的四大要素及实施要点

（一）基因的克隆（分离）

1. 鸟枪法（shot gun）

2. 化学合成

3. 从cDNA库中分离

●cDNA：反转录DNA

如果已知基因的特异mRNA，就可以直接利用该mRNA反转录cDNA（基因）。

值得提出cDNA与原来的基因组的基因序列可能不一样，因为内含子不转录。

●cDNA文库
某一时期等组织基因转录形成mRNA总体反转录成cDNA，这些cDNA总体就称为cDNA文库。

4. 从基因组文库中分离

●基因组文库：将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体、重组、克隆，所产生的克隆群体代表基因组DNA的所有序列，现在已构建的基因组文库主要有：

BAC(细菌人工染色体)，以细菌作为对象，将DNA片段与质粒重组后转入细菌中繁殖。

YAC(酵母人工染色体)，以酵母作为对象。

PAC(噬菌体人工染色体), 以噬菌体作为对象。

TAC(可转化的细菌人工染色体)

MAC(哺乳类人工染色体)

(二)重组DNA的建立

为了实现基因转移，首先需要限制酶将“目的”基因安装在一个特定的运载工具——载体DNA上，在载体DNA的运载和保护下，被转移的基因可以通过适当方法顺利进入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，最后整合到染色体上，达到稳定表达。

1. 运载工具

●作为运载工具的条件

〇在宿主细胞中能自我复制，并能稳定地保存有多种限制酶的切点，每种酶的切点最好只有一个，酶切后并不损坏其复制能力及选择标志基因，并能嵌入外源DNA的片段。

〇具有可作为重组DNA分子选择标记遗传标记。

●原核生物载体的种类

现在有多种载体，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。

〇质粒载体：以细菌质粒（plasmid）的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。
质粒，环状DNA大小1kbp到200kbp。

它们经改造后具有作为DNA运载工具所有的条件。

a. pBR322质粒，广泛应用。


特征：

（a）有36个单一的限制性内切酶位点，（EcoRⅠ，HindⅢ等）

（b）四环素抗性基因Tetr。外源DNA片段插入到BamHI位点时，使Tetr失活，可以通过Ampr Tets来筛选重组体。

b. pUC18/19质粒


     c. pGEM系列多功能载体

●真核生物载体

真核生物载体与原核的不一样。目前所用的大多是所谓的穿梭载体，它们应该具备如下条件：

〇含有原核基因的复制起始序列以及筛选标记

〇含有真核基因的复制起始序列以及真核细胞筛选标记

〇含有有效的启动子序列

〇RNA聚合酶Ⅱ所需的转录终止和poly（A）加入的信号序列。
〇合适供外源基因插入的限制性内切酶位点。

举列：yeast-E.coli穿梭载体

2. 限制性内切酶

细菌细胞对外来DNA具有防御，当DNA进入时，DNA会被一种特殊的酶（即限制性核酸内切酶）所毁灭，这个过程称做限制。

这种限制性内切酶非常有用，它可以把大的DNA——小片段，也可以把运载工具—质粒切成适于携带基因或片段的状态，以便形成重组DNA分子。这是一次巨大的发现。

●类别

第一群以EcoB、Ecok等为代表，能切断双链，切割部位没有特异性。

第二群以EcoR1，HindⅢ（嗜血杆菌）等为代表，能切断双链，切割部位在DNA分子上有特定的碱基顺序，即切割部位具有特异性。


● EcoR1和HindⅢ的特点

〇只在一定核苷酸顺序上起作用
  〇多数可以产生粘性末端，即在酶解时，DNA双链不在同一地方断开，因而产生的片段两端都带有数个碱基的单链尾巴，这两个单链尾巴带有互补的碱基配对顺序，可以互相自动接合成为环状DNA，因此称为粘性末端。

3. 重组DNA分子的建立

有了“目的”基因、载体DNA、限制酶，下一步是DNA的体外重组，就是把“目的”基因牢牢地安装在载体上，使它们共价连接。这就是DNA分子的重组。

DNA的重组主要是采用限制性内切酶法。
同一种限制酶切割不同来源的DNA所产生的DNA片段，虽然区段和大小不同，但单链末端（粘性末端）的顺序和长短都一样。因此，不同来源的DNA片段，可以通过粘性末端对应碱基间的氢键集合到一起，再经DNA连接酶的作用，将切口接合起来，成为一个完整的重组DNA分子（如下图）。

（三）重组DNA的导入

重组DNA的导入方法有多种

1. 转化或转染

●转化：以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞。

●转染：把重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞。

这二种方法导入重组DNA关键的问题是要有感受态的细胞，即处于最适于摄取外源DNA的生理状态的细胞。目前创建感受态细菌的方法是让受体菌经一定浓度的冰冷CaCL2（50~100mmo/L）溶液处理一段时间。   


2. 高压电穿孔法，即基因枪的方法方便，但必须有专门仪器

3. PEG(聚乙二醇)介导的原生质体转化法

4. 磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染

5. 原生质体融合（如下图）  


6. 脂质体法

7. 细胞显微注射法   
   
（四）基因重组体的筛选

1. 利用质粒上特异的筛选标记进行特异筛选

2. 分子杂交筛选

3. 其他的方法
三、细胞工程

1. 体细胞杂交

2. 细胞核移植