免疫乳

guo1984

随着人民生活水平的提高，城乡居民更加注重饮食结构和饮食健康。越来越多的居民已经了解了牛初乳的营养价值极其免疫功能，并且也有对初乳及初乳制品的购买需求，因此在这样的市场环境下，较之初乳及初乳制品更具保健功效的免疫乳及免疫初乳方面的研究也就应运而生了。
1 免疫乳的概念
    免疫乳是指给牛、羊等哺乳动物选择性地接种一些能引起人或动物疾病（主要是肠道疾病）的细菌（如致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等）、病毒（如轮状病毒）或其它一些外来抗原（如隐性孢子虫等）刺激机体发生免疫应答以分泌特异性的抗体（specific antibody）进入乳中，这种乳称为免疫乳（immune milk）。这一过程称为高度免疫。免疫乳中的抗体能够特异性地中和或消除相应的抗原，而不会干扰肠道固定菌群的正常生长。对妊娠期动物接种一种或多种特定抗原所获得的初乳，称为免疫初乳。
2 初乳的成分及其免疫功能
    初乳是自然界富含免疫因子最多的食品之一。主要包括免疫球蛋白(Ig)、乳铁蛋白(Lf)、乳过氧化物酶(Lp)、溶菌酶(Lz)等。
　　曾林等（2000）报道，初乳中免疫球蛋白和补体C3含量极显著高于常乳；补体C4含量也显著高于常乳，且试验观察到产后第3d免疫球蛋白和补体含量达到高峰，以后逐渐下降，与人初乳产后4d总量最多，以后下降基本一致。人饮用免疫乳汁或免疫初乳，就可以获得被动免疫保护，预防一种或多种不同的病原微生物所引起的疾病。
2.1 免疫球蛋白
　　免疫球蛋白是一种受动物体外来大分子抗原刺激而产生的抗体补体是非特异性免疫的主要组成部分，协助抗体和吞噬细胞杀灭病原微生物，担负机体非特异性抗感染作用。在机体免疫应答过程中，除了产生特异性的抗体之外，机体还会产生一些淋巴因子，其中的一些也会随泌乳进行而进入乳中，如在免疫乳中发现的抗炎因子(Anti-hypertension Fator)和抗高血压因子(Anti-inflammation Factor)。
    Ig具有多种生物活性功能，最主要的是能与侵入人体的细菌、病毒等抗原进行特异性的结合，从而使它们丧失破坏人体健康的能力。Ig还具有活化补体、溶解细胞、中和毒素以及通过胎盘向胎儿体内传递免疫力，增强胎儿和新生儿抗感染能力等多种功能。
2.2 乳铁蛋白
　　乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，由转铁蛋白(Tf)演变而来。在牛初乳中的含量约为1.5~5.0mg/ml，是常乳的50~100倍。不同牛个体间含量差别很大，同一个体常乳中乳铁蛋白含量约为初乳的2%。应说明的是Lf并非仅存在于乳中，在鼻、支气管、唾液以及肠道外分泌物中也有发现。同时，Lf不仅能结合铁，也能结合铜(Cu2+)离子，Lf能通过吸附在细菌表面膜蛋白的特定部位，夺取细菌生长繁殖所需的铁，具有强烈的抑菌或静菌效应。在婴儿肠道中，铁离子较少，Lf夺取细菌生长所需的铁源，抑菌作用更为明显。此外，它还具有调整补体活性、调节免疫系统、抑制炎症、刺激淋巴细胞生长、抗病毒、中和毒素、促进铁吸收、抑制活性氧产生、防止脂肪过氧化、调整胃肠道微生物类群等多种作用。
2.3 乳过氧化物酶
    乳过氧化物酶（Lp）是一种约占0.07%铁的血红素蛋白，因碳水化合物的含量不同而分为多种形式。在牛初乳中的含量为11~45mg/l。奶牛分娩后第1次所挤初乳中含量较低，此后迅速升高，并在4~5d达到峰值。Lp单独存在时并不能发挥生物功能，当和代谢产物H202、SCN-(硫氰酸根)组成“乳过氧化物酶体系”(LPS)，也即H202/LP/SCN-体系后，可抑制和杀灭假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌等多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及过氧化氢酶阳性、阴性菌。LPS体系还可用于生鲜牛奶保鲜，延长保存时间，并已研制出几种保鲜剂，在生产实践中得到应用。
2.4 溶菌酶
    溶菌酶（Lz）是一种专门作用于微生物细胞的碱性球蛋白，又称细胞壁溶菌酶。在牛初乳中的含量为0.14~0.7mg/l，是常乳的2倍。对大多革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌有溶解能力，具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等作用，并可增强双歧杆菌的生长能力。Lz的生理功能首先在于抗菌，它能降解细菌细胞壁，包括一些病原性真菌细胞壁中所含的几丁质。
2.5 免疫细胞
　　免疫细胞牛初乳中所含免疫细胞总数为1×106~1×107个/ml有γ淋巴细胞、β淋巴细胞、巨噬细胞及嗜中性粒细胞等。这些细胞能分泌特异性抗体，产生干扰素，或者表现为直接的吞噬作用，对保护免疫系统尚未发育成熟的新生儿具有重要意义。牛初乳中的免疫细胞，特别是淋巴细胞能提高体液免疫力。
2.6 生长因子
　　牛初乳中的生长因子有胰岛素样生长因子(IGF一I和IGF一II)、转化生长因子和成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)等。其中，胰岛素样生长因子IGF一I和IGF一II是两种肽类化合物，因其结构和胰岛素有相似处而得名。在牛初乳中IGF的浓度约为200μg/l，大约为常乳的10倍。IGF能促进细胞有丝分裂，诱导蛋白质、RNA的合成和增殖，刺激糖、氨基酸循环，并最终促进机体生长发育，为新生婴儿或仔畜尽快适应环境打下基础。
3 免疫乳的生物学功能
　　免疫乳最直接的作用是抗肠道病原微生物感染，预防和治疗肠道病原菌引起的腹泻。张和平等(2000)通过对牛进行高度的系统免疫（Hyper immunization），乳抗体的特异性较非免疫组提高几十至几百倍。许多研究表明，不同的免疫乳具有如下不同的作用：①缓解关节炎、尤其是类风湿性关节炎患者的疼痛、肿胀，改善关节运动，改善睡眠和精神状态②防治高胆固醇症，降低高血脂症患者的血清胆固醇和血脂积累，预防动脉粥样硬化③保护心血管系统，改善其功能，消除主动脉管壁上的脂肪沉积，防止血栓形成④改善肺功能，缓解呼吸道疾病，减轻吸烟对人体的危害⑤预防轮状病毒、大肠杆菌、志贺氏菌、空肠弯曲杆菌等引起的腹泻⑥预防霍乱、破伤风、艰难梭状芽孢杆菌感染，并中和其毒素；⑦预防幽门螺杆菌感染及其引起的胃炎、胃溃疡⑧抗隐性孢子虫病⑨预防龋齿、牙周炎及各种口腔疾病⑩通过抑制新生血管增生、活化巨噬细胞和其它淋巴细胞，抑制肠道微生物产生有害物质以及抗辐射等途径，预防和辅助治疗癌症11抗肠道病毒和甲型、乙型肝炎病毒，科萨基病毒，降低肝炎及肝癌发病率12抗炎症，减轻病原菌感染的炎症反应，辅助治疗多种慢性病13抗过敏，通过调节免疫系统功能，有效地预防或缓解过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性皮炎等病症；14抗破伤风毒素引起的中毒。
4 免疫乳的制备
　　免疫乳的开发目的是将异源的乳抗体用于人肠道疾病的预防和治疗，主要是针对病原微生物导致的腹泻。但是由于长期的生物进化，不同的物种，其乳汁中抗体的特异性不同，如牛乳中的抗体其特异性主要是针对牛的病原微生物而言，对人病原微生物无特异性或特异性不强，若将非特异免疫的牛乳球蛋白直接用于抗人肠道病原微生物的感染，其作用很小或几乎没有什么作用。因而必须以人的病原菌为抗原对牛体进行高度免疫，以获得对人病原微生物具有特异性的乳抗体，只有这样用于人后才能起到抗感染的作用，这是免疫乳开发的宗旨。
　　对于免疫乳的制备，根据实际应用情况，可使用单一抗原，亦可采用混合抗原制成多价疫苗，从目前趋势来看，采用多价抗原更为有意义，这样在免疫乳中可以同时获得许多不同的抗体，如美国 Stole Milk Biologics International采用26种病原微生物制成混合疫苗生产免疫乳。
5　制备免疫乳的一般步骤
5.1 免疫抗原
    采用中科院上海细胞所研制的专用于奶牛免疫注射的抗病毒性甲肝、乙肝和病毒性流感的复合免疫抗原。
5.2 受体奶牛的选择
    体质健康，泌乳性能好，已繁育1~3胎，不同妊娠和泌乳阶段的青年奶牛。进行免疫注射奶牛最低不少于14头(免疫牛乳可稀释30~100倍)，同时应配备一个一般日产10t消毒牛乳的乳品加工厂。
5.3 免疫原注射   
    分为基础强化和正常维持两个阶段。在基础强化免疫阶段，即在104~120d内多次对奶牛免疫原注射，反复刺激奶牛产生抗体。正常维持阶段，按规定时间和程序给奶牛经常注射免疫原，使奶牛不断产生抗体。
5.4 免疫乳加工
    采用巴氏灭菌法或超高温瞬时灭菌法进行鲜奶的消毒，然后采用塑膜或玻瓶等包装形式进行贮存。
5.5 免疫抗体检测
    采用ELISA检测特异抗体的免疫活力及免疫球蛋白的相对含量。也可以用琼脂单项免疫扩散法测定牛乳免疫球蛋白和补体含量。如检测免疫乳样与普通消毒对照乳OD平均值之比均大于I.5，证明特异抗体存在，免疫球蛋白相对含量较高。
6 免疫乳的研究进展
    美国和西欧的学者对免疫乳已有较多的研究，特别是20世纪80年代末期，SMBI把其免疫乳产品推向市场以来，人们对该领域的研究更为关注。中国对免疫乳的研究起步较晚，始于20世纪90年代末期，但已有一定的进展，开发出了能用于预防和治疗胃肠道感染的免疫乳，抗甲肝病毒、乙肝病毒和幽门螺旋杆菌的免疫乳及抗人体消化道病原微生物免疫牛奶和抗病毒免疫牛奶，有人还探讨了抗轮状病毒和抗大肠杆菌的免疫乳中抗体的消长规律。
　　郁凯明等(1997)用免疫牛初乳治疗轮状病毒感染性婴幼儿腹泻，总有效率达91%，显效率达79%，无任何副作用。张和平等(1997)用大肠杆菌、沙门氏菌和轮状病毒制成的混合疫苗对泌乳母牛进行免疫，生产出含多种特异性抗体的免疫乳，经测定，在试验期内(母牛分娩后210d)，免疫乳中IgG活性平均为379.55，而非免疫乳中IgG活性仅为48。他们还对免疫乳中Ig的分离和纯化、Ig对病原微生物的抑制作用、胃蛋白酶和胰蛋白酶对Ig活性的影响、Ig的热致变性以及免疫乳粉的制备做了系统研究和阐述。
　　张和平等(2002)以病原性大肠杆菌、沙门氏菌等24株人肠道病原菌作为抗原，对奶牛进行系统免疫，所得免疫初乳中乳抗体对24种不同病原菌的凝集价为普通初乳的32~256倍，免疫常乳中乳抗体对24种不同病原菌的凝集价为普通常乳的128倍。许晏等.(2004)研制开发出针对9种常见肠道致病菌的免疫乳，免疫母牛初乳中特异性IgG效价为210~212，常乳中特异性IgG效价为26~210，分别比非免疫母牛初乳和常乳中IgG效价提高2~9倍和8~14倍。唐东平等（2003）用奶牛免疫乳抗体提取物进行抑菌试验，免疫乳中的抗体表现出较强的抑菌效力。当提取物中的Ig以终浓度为1.0mg/ml加入到霍乱弧菌和伤寒杆菌的培养液中时，能有效地抑制霍乱弧菌和伤寒杆菌的生长。此外，第四军医大学等开发多价免疫牛乳也取得成功。他们采用基因工程技术，将HBV表面抗原与HCV核心抗原基因重组于原核高效表达载体，制备成基因工程苗免疫奶牛，生产出抗肝炎病毒的多价特异性免疫乳。这种免疫乳含有表面抗体和多种红胞活性因子，可中和乙型肝炎病毒，使病毒失去感染能力，并可提高人体免疫力，抵御丙型肝炎病毒的感染，促进肝炎患者康复。
7 结束语
　　虽然大多数对免疫乳中抗体进行的抑菌试验结果表明，免疫乳中的抗体有较强的抑菌效果，但这种体外分析试验并不能完全代表体内的情况，抗体进入人体后，会在酸性条件下被胃蛋白酶水解，同时在肠道的碱性环境下被肠道的蛋白酶水解，抗体是否能保持其抗体活性，或抗体活性的持留率的大小还有待于用试验进一步的分析。
　　有部分体内和体外的试验显示，乳中抗体在酸性环境经胃蛋白酶水解及在碱性环境经胰蛋白酶的水解后仍然还保留有抗体活性。这一方面可能是由于乳中大量的蛋白质缓冲了胃蛋白酶及胰蛋白酶的水解作用，另一方面也可能是胃蛋白酶及胰蛋白酶水解得到的抗体Fab片段仍然保留有抗体结合抗原的能力。其免疫机理还有待进一步深入研究，免疫乳中特异抗体在体内环境条件下的作用机制尚需试验进一步查明，免疫乳中其它活性成分对机体及病原的作用也还要进行试验的分析和论证，这对于免疫乳的进一步开发和研究有深远的影响。