酸溶蛋白能否用来判定发酵豆粕中的小肽含量？【三】

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发酵豆粕含有丰富的益生菌及其代谢产物，这些物质可改善动物肠道微生态环境，有利于营养物质吸收。与豆粕相比，发酵豆粕含有丰富的小肽、氨基酸，有利于合成动物体内自身氨基酸和组织，提高机体免疫能力，抵御外来病原体入侵，目前行业普遍用酸溶蛋白指标评估发酵豆粕中小肽含量，该指标是否能对发酵豆粕品质进行“代言”呢。

一、肽的概念

定义：食品国家标准《大豆肽粉GBT 22492》2008 版将小肽的定义由<10 KDa 降低到<5 KDa。营养学上关于小肽的定义稍有差别，但是以分子量范围来定义是共识。

检测原理：高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物(酸溶蛋白质)可溶于酸性溶解液(其中包含肽及游离氨基酸)。样品经酸化后，滤液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为肽含量。(GB/T22492-2008大豆肽粉)

二、酸溶蛋白

酸溶蛋白是目前饲料行业用于检测发酵豆粕中小肽含量的一个指标，具有成本低，易于操作的优点。

通常情况下，多肽链的水溶性取决于形成多肽的氨基酸之间的肽键和氨基酸侧链和水分子之间的相互作用力。多肽和蛋白质的离子特性和溶解性都取决于组成它的氨基酸的特性。

在受到外界不平衡条件的情况下，如物理条件(高温，紫外线，剧烈振荡等)和一些外部环境化学成分的变化(强酸，强碱，重金属盐等)，会使得蛋白质的侧链带电情况发生变化，从而导致进一步的分子结构发生变化。(如图二)。在高浓度的三氯乙酸溶液里，蛋白分子会与之相互作用，形成不溶性盐;同时强酸作为变性剂，会使得蛋白质的构象发生改变，暴露出较多的疏水基团，使之聚沉。

影响酸溶蛋白数值的三个因素：肽链的长度、疏水性以及低pH下蛋白片段的带电情况。这三个因素共同决定溶解在三氯乙酸溶液中的蛋白含量，肽链长度越长，疏水性越强，溶解度越小。

因此，发酵豆粕的酸溶蛋白含量，很大程度上的取决于发酵使用的菌株特性，芽孢杆菌，乳酸菌，酵母菌，霉菌等，由于不同的菌株代谢产生的酶的种类不同，通过发酵产生出来的大豆蛋白片段长短，末端氨基酸，蛋白片段的氨基酸种类和带电性不同，使得在高浓度的三氯乙酸中溶解程度是不一样的。

实验证明，15%TCA溶液能溶解的蛋白质分子量范围是在5kDa以下(见下图三)，最大部分溶解的是2kDa(由约18个氨基酸组成)左右大小的蛋白质分子。

图三是利用凝胶渗透色谱法(GPC, HPLC的一种)测定的蛋白质分布情况。在凝胶柱中，蛋白质大分子通过由于无法进入凝胶中的孔径，因此从凝胶间孔径快速通过，在色谱图的前端出现;蛋白质小分子可通过凝胶中的孔径，因此洗脱缓慢，在峰值的后端出现。

我们可以看到图三中，图谱的结果是不同种类的发酵豆粕产品在三氯乙酸中溶解出来的上清液中的蛋白质分布情况，可以看到蛋白的峰值是从5kDa开始出现的，最高的峰值出现在2-3kDa之间，说明了TCA溶解出来的小肽的分子量都在5kDa以下的。

然而，并不是所有小于5kDa的多肽分子都能被溶解。(见下图四)

图四中实验结果，同时测定的发酵豆粕样品整体蛋白分布(红色峰)和三氯乙酸溶解后上清液的蛋白分布结果(蓝色峰)。可以看到，三氯乙酸提取的分子量5kDa以下蛋白质部分，而红色图谱和蓝色图谱之间存在一个灰色的面积区域是TCA没有办法提取出来的样品中的肽含量的部分，即TCA并不能完全溶解出样品中的所有的肽，只能溶解出其中的一小部分。因此，利用酸溶蛋白溶解出来的蛋白含量来判定样品的小肽含量，结果是片面的，不准确的。

这是因为酸溶蛋白的值大小取决与多肽片段的大小，以及构成蛋白质的氨基酸和多肽的疏水性，因此，三氯乙酸沉淀的并不都是大分子蛋白质;同时一些非蛋白氮和游离氨基酸也会被溶解在上清液中一起被检测出来。另外，由于三氯乙酸本身的刺激性气味，强酸，强腐蚀性，我们都不建议使用三氯乙酸沉淀法去判断小肽含量。

目前，现有的小肽检测方法——酸溶蛋白显然并不能准确的反应发酵豆粕中肽的含量;最准确的可以测定出小肽含量和小肽分布情况的方法是利用高效液相色谱去测定，但由于需要专业的技术人员和设备，检测成本相对较高，一般不作为出厂检测的推荐方法。韩国希杰集团研究所在发酵豆粕-速益肽产品的长期研究过程中，韩国希杰集团研究所在发酵豆粕-速益肽产品的长期研究过程中发现发酵豆粕的水溶性蛋白(NSI值)含量和高效液相法(GPC<30 kDa的肽含量)测定肽含量值存在高度正相关关系。在后续推文中会详细阐述，敬请关注!

（文章来源：CJ希杰BestProtein）