副猪嗜血杆菌的分离鉴定

bluewing2003

副猪嗜血杆菌（HPS）引起猪的多发性浆膜炎与关节炎，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,我国以血清4型和5型最为流行，其次为13型、14型和12型。下面就如何分离鉴定HPS做一个阐述。
一、病原菌的分离、鉴定
无菌操作从疑似病猪的鼻腔、肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料中取样，在无菌操作台上，用接种环分别挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于无NAD的绵羊鲜血平皿上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24-48h，看是否有“卫星生长现象”（即在葡萄球菌菌苔附近待测菌菌落生长较大，而远侧菌落生长较小甚至没有菌落生长），同时观察是否具有溶血现象。取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养后接种于脲酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微型生化鉴定管，按厂家说明书的方法操作并观察结果。
二、结果判定
副猪嗜血杆菌在绵羊鲜血琼脂平板上与金黄色葡萄球菌交叉划线，37℃培养24~48h后，呈现典型的“卫星生长现象”，即越靠近葡萄球菌的周围其生长越好，远离葡萄球菌的地方不生长，并且在鲜血琼脂平板上的副猪嗜血杆菌菌落周围不出现溶血现象。将副猪嗜血杆菌接种于微量生化鉴定管，37℃培养48h后，结果为脲酶试验阴性，氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性并发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等碳水化合物

生化鉴定项目	HS79(4型标准菌)	HS80(5型标准菌)
NAD-依赖性	+	+
溶血性	-	-
脲酶	-	-
硝酸盐还原	+	+
吲哚	-	-
氧化酶	-	-
接触酶	+	+
葡萄糖	+	+
麦芽糖	+	+
蔗糖	+	+
果糖	+	+
核糖	+	+
半乳糖	+	+

三、分子生物学检测(PCR)将被检菌株菌液10,000r/min离心5min，弃上清液，用无菌水悬浮，涡旋后，于沸水中水浴10min后，再放置-20℃冻结。冻融后10,000r/min离心5min，取上清液作模板。或将分离纯化的菌株用接种环刮取2个菌落洗脱于含100µl无菌水的离心管中，再同上涡旋，水浴，冻融及离心作模板。
根据副猪嗜血杆菌16S rRNA（M75065）序列设计引物，由上海生工公司合成：
上游引物：5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT –3
下游引物：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT –3
反应体系（50µl）：10倍缓冲液5µl，25mmol/L MgCl2 1.5µl，dNTPs 1.0µl，1.5umol/L上游引物1.5µl，1.5umol/L 下游引物1.5µl, ExTaqE 0.5µl，灭菌双蒸水9µl，模板10µl。反应条件：94℃变性4min；94℃ 50s，59℃ 50s，72℃ 1min，72℃ 10min，PCR产物4℃保存。
四、结果判定根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物经PCR扩增的产物为822 bp大小的片段。

潲水娃

好高深莫测，看不懂