副猪嗜血杆菌与Glässer氏病研究进展

4  临床症状

副猪嗜血杆菌感染后出现的临床症状与感染部位有关。Hoefling（1994）将其分为4种类型，即Glässer氏病（纤维素性多发性浆膜炎）、败血症型（无多发性浆膜炎）、急性肌炎型（myositis acuta ，见于咬肌）和呼吸病型。

各型临床表现，其绝大多数都是非特异性的。病程呈最急性或急性经过。发病猪通常是十分健壮的猪。最初的症状是体温升高、精神沉郁和食欲减退，接着出现咳嗽、呼吸困难、体重下降、跛行、共济失调、发绀、卧地不起等症状。有的病猪衰竭而死。

引起发烧的细菌和病毒有很多种，如胸膜肺炎放线杆菌、猪放线杆菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌、猪鼻支原体、流感病毒等。对于这些需要通过鉴别诊断加以排除。

5  诊断

    副猪嗜血杆菌感染的临床症状不具特异性，因此临床诊断意义不大。确诊病性需要进行实验室检验。

5．1 病理变化

    本病的主要变化是在腹膜、心包、胸膜或关节面出现浆液-纤维素性或纤维素性化脓性炎症。组织学检查这些炎症部位可见嗜中性白血细胞和巨嗜细胞浸润。在重剧病例如脑膜炎、栓塞性脑膜脑炎，伴有脑脊液增多。肺部病变不典型。败血症病例可在肝、肾和脑等器官表面见到出血斑（点），同时血浆中内毒素含量增加，各器官出现纤维素凝块。伴有发绀、皮下水肿和肺水肿的急性败血性病例不多见，也见不到典型的浆膜炎症表现。

  5．2 病原分离

    从病料分离副猪嗜血杆菌，通常在接种了金黄色葡萄球菌的血液琼脂上进行，目的是通过金黄色葡萄球菌为副猪嗜血杆菌的生长提供NAD。也可以选用巧克力琼脂或者加有NAD的PPLO培养基。培养时间通常需要24~48h。本菌为难于培养的微生物之一，尤其是从病料中分离时，常常受到杂菌的干扰。解决的办法，一是采用稀释培养法，二是在培养基中加林肯霉素和抗菌肽。由于本菌为上呼吸道常在菌，因此，必须注意由呼吸道分离到本菌并不一定代表发生了全身性感染。但是，当在脑和关节内检出副猪嗜血杆菌，其诊断价值就不容置疑了。另外，当分离到副猪嗜血杆菌样细菌时，必须对其作细致的生化鉴定，将之与其它不溶血的NAD依赖细菌如吲哚放线杆菌、猪放线杆菌和小放线杆菌等区别开。

5．3 血清定型

    如上所述，副猪嗜血杆菌的血清型已经根据特异性兔抗血清免疫扩散试验的结果，确定了15个血清型（1~15）。最近，还有人对不同的血清学分型方法[免疫扩散试验(ID)、间接血凝试验（IHA）和协同凝集试验（CA）]进行了比较研究（Río等，2003；Tadjine等，2004；Turni和Blackall，2005）。

    Turni和Blakall(2005)比较了ID和IHA检测野毒株的结果后发现，IHA产生比ID更多的不可分型菌株，前者达44％，后者为41％。Del Rio等（2003）和Tadjine等（2004）的研究则认为，最适合副猪嗜血杆菌血清分型的方法应该是IHA，因为IHA减少血清学不可分型的百分数至少比ID或CA低10％。其他学者详细分析了Del Rio和Tadjine等的研究结果后发现，他们的研究方法有缺陷，即所检测的菌株没有一株是国际认可的标准菌株，所采用的抗原提取技术也没有经GD试验校正。因此，他们的研究结果受到质疑。

    分离菌株不可定型的原因，可能是其所含型特异抗原的数量不足，也可能是至今尚未被认知的血清新型。ID和IHA分型结果出现差异的原因，是由于所用的可溶性天然抗原都是用于ID的。因为，IHA试验是用可溶性抗原包被红血细胞，其结果是把沉淀抗原当凝集抗原使用，从而使IHA试验的敏感性比ID试验提高了3000倍（Mittla，2003）。

5.4 抗体检测

    补体结合试验（CF）、间接血凝（IHA）试验和ELISA试验都可用于检测副猪嗜血杆菌的抗体。急性病例经过一周的病程即可检出抗体，但都有较明显的型交叉反应性。Takahashi等（2001）作了免疫接种试验，他通过CF试验检测抗体滴度，其结果在二免后19d呈现阳性滴度。研究发现，无论是用超声粉粹的还是用加热煮沸的菌体作包被绵羊红细胞的抗原进行IHA，无论是用煮沸细菌的上清液还是用酚：水热抽提物透析液作抗原进行ELISA，都只能获得不稳定的阴性结果，特别是在检测免疫动物时。因此说，这些试验不宜用于检测免疫保护反应。但是，如果改用福尔马林灭活的全菌体作抗原进行ELISA试验，则可用于研究母猪的抗体滴度和仔猪的疫苗接种反应。

5.5 分子生物学方法

    这类方法中，一个很有应用前景的方法是寡核苷特异性捕捉平板杂交试验（OSCPH，oligonucleotide-specific capture plate hybridization），其敏感性很高，为102CFU/mL纯培养物。问题是不容易获得纯培养物。因此，又建立了一种能直接鉴定病料中副猪嗜血杆菌的PCR方法，其敏感性亦达102CFU/mL。而且，可以用于检测已灭活的病菌。然而，这两种方法对吲哚放线杆菌都可以呈现弱阳性反应。由此，Oliveira和Pijoan（2004）推荐这两种方法只用于检测呼吸道以外的副猪嗜血杆菌，因为吲哚放线杆菌是上呼吸道中的常在菌。

5.6免疫组化诊断

     由于杂菌滋长而使副猪嗜血杆菌分离异常艰难，因此有人推荐用免疫组化法（IHC）来诊断副猪嗜血杆菌感染。IHC的优点是，即使副猪嗜血杆菌已被巨噬细胞杀灭而遗骸于胞浆中，也可轻易地被检测到。

    问题是本方法中所使用的多克隆抗体与胸膜肺炎放线杆菌有交叉反应（Segales等，1997）。

6  治疗和预防

    与其它疾病一样，卫生恶劣、营养不适和管理不当等诱因都可以促进副猪嗜血杆菌感染的发生和流行。特别是无序转群，以及在同一圈内饲养不同年龄的猪只，更是促成本病暴发的诱因。

6.1 抗菌素治疗

    副猪嗜血杆菌病可以用抗菌素治疗。治疗要求尽早尽快，症状一旦出现即应经胃肠外途径给药。用药剂量因症而异。对于Glässer氏病，由于病原进入组织和脑脊液以及侵害关节，用药剂量一定要大。

    用什么抗菌素，应该根据药敏试验结果来选择。有关本菌抗药性的报道不多、瑞士分离到的所有副猪嗜血杆菌菌株对青霉素和恩氟沙星均敏感，对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、红霉素、磺胺嘧啶和TMP+磺胺嘧啶都有抗性（wissing等，2001）。丹麦菌株对所测抗菌药物(氨苄青霉素、头孢替福、环丙沙星、红霉素、氟苯尼考、青霉素、壮观霉素、四环素、硫粘菌素、替米考星、TMP+磺胺甲基异恶唑)都十分敏感（Aarestrup等，2004）。

6.2 免疫预防和疫苗接种

    通过疫苗接种来控制副猪嗜血杆菌感染，可能比较实用些。虽然对本菌的毒力因子和保护性抗原何在还不清楚，但确实存在型特异性的免疫力。所用疫苗可以由厂家购买，也可以制作自家菌苗。在自家菌苗控制疾病的过程中，既要考虑制苗菌株的血清型，也要重视制苗菌株的其他因子。因为从一头猪可以分离到强毒至无毒的各种菌株。由此推荐：最好使用由脑内分离到的菌株来制备自家菌苗；否则，如果用从关节和身体其他部位分离到的菌株制苗，免疫效果会变差，而用肺内菌株制备则可能几乎无效。其原因如前所述，不同部位来源的菌株有非常高的异源性（heterogencity）。

    由于副猪嗜血杆菌血清型的多样性和大比例的不能定型的分离物的存在，迫使人们在努力寻找能够产生交叉保护力的疫苗。Miniats等（1991）曾经试图使用含有高致病力或低致病力菌株的菌苗来诱导交叉保护性免疫反应。结果是，抵抗同源性和异源性菌株的交叉保护作用只有用毒力菌株制备的菌苗才能得到，低致病力菌株制备的菌苗接种的猪，仅能保护同源菌株的攻击。Rapp-Gabrielson等（1997）在研究血清2、4、5、12、13和14型间的交叉保护性时发现，除了血清12型制备的单菌和血清2、12型制备的二价苗外，其他型都能对同源菌株产生保护；用血清4型制备的菌苗，可以保护血清5型的攻击；用血清4、5型制备的二价菌苗，可以抵抗血清13、14型的攻击（仔猪病变的严重性和病死率明显降低）。该作者还进一步研究了血清12型菌苗对同源菌株的保护性反应。血清12型有12a和12b两个亚型，分别以之制备菌苗来免疫猪发现，以12a制备的菌苗不能产生同源性保护，而用12b免疫，则能产生显著的同源性保护。这些事实表明，尽管血清12型菌株都是高致病性的，也能产生相似的OMP和LPS，但菌苗中所表达的保护性抗原肯定是有所不同的。Takahashi等（2001）研究了血清2和5型之间的交叉保护性，证明单价菌苗免疫不能产生交叉保护，但用其二价菌苗免疫，然后用致死量的2、5型菌株分别攻击，双双都能获得保护。Bak和Riising（2002）研究了血清5型+DiluvacForte佐剂菌苗的保护性，仔猪在5周龄和7 周龄接种菌苗后，所产生的保护力不仅能抵抗血清5型同源菌株的攻击，而且对血清1、12、13和14 型等异源菌株的攻击也都能产生明显的保护作用。

    为了预防仔猪发病，可以让仔猪小剂量地感染致病性菌株。该方法的理论基础是基于这样一种假设：在自然状态下，猪群中很少有猪定植有致病性菌株；细菌早期定植于仔猪后，仔猪不仅可因有母源抗体而免发全身性感染，当母源抗体减少时仔猪能获得主动免疫反应。有人通过田间试验证实了这种假设，即仔猪在5日龄时经口接种7×103CFU强毒活菌，感染猪的病死率比对照猪降低了2.88%。但要切记：感染有PRRS病毒的猪不能使用这种方法。

    疫苗接种的另一个问题是用苗时机问题。有学者不同意疫苗接种影响自动免疫的观点。他们证明：对母猪和仔猪接种疫苗同样有效，认为初乳抗体不能干扰疫苗效果。也有人持不同观点，如果母猪什么都不接种，只是仔猪接种疫苗，结果无效。因此，为了保证仔猪断奶前和断奶后都能对疫苗接种产生免疫反应，有必要重视设计疫苗接种的策略。Oliveira和Pijoan(2002)证实，母猪分娩前免疫产生的乳汁免疫以及断奶仔猪的疫苗接种和再接种都能够提供必要的保护作用。

7   结论与建议

    在过去的数年中，虽然人们愈益重视了对副猪嗜血杆菌感染的研究，但至今仍有许多问题不能得到满意的回答。特别是对毒力因子的检测、毒力因子的作用机理、诊断方法的改进和新型广谱疫苗的研发等，需要格外重视加以研究。

    在我国，在注视PRRS病毒、PR病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒等疫情的同时，应该注意到副猪嗜血杆菌的并发或继发感染（帮凶）作用。尤其在集约化程度很高的大型猪场，更应汲取国外的经验教训，更加重视副猪嗜血杆菌的潜在危害性。在疫苗研究过程中，要根据我国猪场疫情的特殊性，要着手研制副猪嗜血杆菌多价苗，还要开始研制预防多种疾病的联苗。