副猪嗜血杆菌与Glässer氏病研究进展

副猪嗜血杆菌与Glässer氏病研究进展

宣华教授

（广东省农科院兽医研究所  　广州五山 510640）

    目前，副猪嗜血杆菌感染已成为全球性的问题。在近几年内，我国已从北京、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖北等地区的一些猪群中分离出副猪嗜血杆菌。

    副猪嗜血杆菌感染可呈现多种临床类型，典型经过的者称作Glässer氏病（Glässer＇s Disease），以纤维素性多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为其临床特征。有的无多发性浆膜炎变化但呈急性肺炎经过，也有呈急性败血症经过的。发病年龄从2周龄至4月龄，通常多见于5～8周龄的仔猪。卫生状况良好的猪群，一旦遭遇到应激因素，往往更易爆发本病，感染过程往往也更为严重，发病率和病死率都会很高，如发病率可达到10%～15%，病死率可达到50%。副猪嗜血杆菌是上呼吸道的常在微生物，是一种机会致病菌，可以并发或继发于蓝耳病、伪狂犬病、细小病毒病、圆环病毒病、猪瘟等疫病，使疫情复杂化，经济损失加重。副猪嗜血杆菌感染与猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌等病原体一起已经共同成为当今现代化集约猪场新的麻烦问题之一。

1 副猪嗜血杆菌

    Glässer（1910）首次报道，他在患有浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎的病猪的渗出液中发现了这种革兰氏阴性细菌，但分离培养成功的人可能是Schermer 和Ehrlich（1922）。

    在研究早期，曾把需要Ⅹ（铁卟啉）和Ⅴ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）两种生长因子的猪嗜血杆菌（Haemophilus suis） 视为Glässer氏病的致病菌。后来，Biberstein和White（1969）证明来自Glässer氏病的病原菌只需要NAD。因此，他们提议把不需要补给X因子的嗜血杆菌在命名时加前缀“para（副）”以示区别，从而提出一个新种——副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）。

1.1形态

    副猪嗜血杆菌是巴氏杆菌科嗜血杆菌属中一种小杆菌。革兰氏阴性，不能运动，带荚膜的菌株一般呈球杆状，无荚膜的菌株形态多样，呈杆形或丝状。经热抽提、电泳分离和十六烷三甲基溴化氨（Cetavalone）沉淀后发现，荚膜中含有多种多糖物质（Morozumi和Nicolet，1986）。在鸡胚绒毛尿囊膜上生长时，本菌还可形成丝状形态，并产生菌毛样结构(Munch 等,1992)。

1.2培养和生化特征

    本菌的生长需要使用含有Ⅴ生长因子的培养基如巧克力琼脂、Levinthal琼脂、加NAD的PPLO琼脂等。在血液琼脂上本菌在金黄色葡萄菌菌苔周边呈卫星状生长，不产生吲哚，发酵葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖和麦芽糖。

    当从猪呼吸道分离细菌时，可能会分离到其他不溶血、脲酶阴性、依赖NAD的类似细菌。过去，把这类细菌用嗜血杆菌“小群（minorgroup）”一词来统纳，并有C、D、E、F之别。如果进行深入详细的生化分析，即可将它们与副猪嗜血杆菌区分开。D、E、F群为上呼吸道中常在的菌群，但也可以从肺或脑组织中分离到。Moller等人（1993）在DNA同源性分析的基础上指出，D和E群属于同一种，故将这两个群合并。随着研究的深入，Moller等（1996）提出了三个新种，对应于“minor group”、D+E群和F 群，这3个新种分别是小放线杆菌（Actinobacillus minor），猪放线杆菌（A.porcinus）和吲哚放线杆菌（A.indolicus）。对所有来自呼吸道的V因子依赖的细菌进行16SrRNA序列比较分析后发现，副猪嗜血杆菌与吲哚放线杆菌（F群）关系最为密切，同源性达到97.4%到97.7%。两者的差别是，吲哚放线杆菌可以产生吲哚和发酵棉子糖。

1.3血清型

    血清分型研究结果表明，副猪嗜血杆菌各菌株的抗原性具有高度异源性。Bakos等（1952）依据沉淀试验的结果报告存在A、B、C、D四个血清型，之后，Morozumi和Nicolet报告了7个血清型（1～7），Kiestein等(1991)又增加了6个（Jena6～Jena12）。Kielstein和Rapp－Gabrielson（1992）又鉴定了5个新血清型（ND1～ND5）。为了使血清分型得到统一， Kiestein和Rapp－Gabrielson（1992）根据用特异性兔抗血清进行的免疫扩散试验结果，提出了猪副嗜血杆菌新的血清型分类体系，即保留过去已证实的血清型1～7，血清型Jena和ND合并为血清型8～15。目前，这一分型方法已被各国采纳，并明确副猪嗜血杆菌现有15个血清型（1～15）。值得一提的是，尽管如此，还是有大量的分离株不能被分型。

    许多国家研究了本菌血清型的分布情况。在日本、法国、美国、西班牙、加拿大和中国，以血清4型为优势型，血清5型也经常分离到(Morikoshi等，1990；Kielstein和Rapp-Gabrielson，1992；Rubies等，1999；；Tadjine等，2004；Cai等，2005)。澳大利亚和丹麦流行的是血清5和13型（Blackall等，1996, 1997；Rafiee和Blackall，2000；Angen，2004）。

1.4 毒力和毒力因子

    副猪嗜血杆菌的毒力因子迄今尚未搞清。血清学分型通常要考虑到与毒力的关系。用血清5、10、12、13和14型菌株经腹腔途径感染SPF猪，其发病和病死高峰集中在4d之内，因此认为，它们强毒血清型；血清2、4和15型引起多发性浆膜炎，无死亡，为中毒力型；剩下的血清型（3、6、7、8、9和11）不引起任何临床症状，为无毒血清型（Kielstein and Rapp-Gabrielson, 1992；Amano 等,1994）。从病猪呼吸道和其它部位分离到菌株，血清型别相似，有血清2、4、5、12、13和14等型。北美地区血清型流行状态的调查结果表明，呼吸道以外部位分离到的菌株，血清型主要是1、2、4、5、12、13和14，以及许多还不能分型的。来自健康猪上呼吸道的，主要是血清3型和不能分型的。

    众所周知，巴氏杆菌科成员具有一些非常重要的毒力因子如荚膜、菌毛、脂多糖（LPS）、外膜蛋白(OMP)等。但是，副猪嗜血杆菌是否就产生这些毒力因子，以及它们与本菌的毒力是否有关，目前还知之甚少，彼此矛盾之处颇多。

    有人运用人工感染试验研究了荚膜与毒力的关系。据Little和Harding（1971）以及Morozumi和Nicolet（1986）报道，从健康猪鼻腔和病猪病料中获得的菌株，带荚膜的并不多。

    Munch等（1992）证明，副猪嗜血杆菌在体内传代后能够生成菌毛样结构，但其致病作用不清楚。

    LPS可能是一个重要的毒力因子。但是，Zucker等（1996）又未发现强毒株的LPS与无毒株的LPS有明显的差异。同样，Miniats等（1991）发现，用含有LPS和OMP抗原的菌苗免疫动物，仅是有OMP抗体的猪才能抵抗强毒菌的攻击。这些事实似乎表明，LPS不是副嗜血杆菌的主要毒力因子。之后，Amano等（1997）进一步研究了LPS的致病作用，他用血清5型菌株接种动物后发现，血流中LPS抗体的出现与血栓形成和弥漫性血管内凝血有关。现已清楚，副猪嗜血杆菌的LPS具有与其它革兰氏阴性细菌内毒素相似的活性（Raetz和Whitfield，2002）。

    应用SDS-PAGE技术发现，副猪嗜血杆菌的外膜蛋白(OMP)具有2个完全不同的生物型：生物1型和生物2型。由健康猪鼻粘膜分离到的菌株表达生物1型OMP，其分子量一为约68Kda，另一在23～40KDa之间。由Glässer氏病病猪分离到的菌株通常含生物2型OMP，其以约37KDa的优势蛋白为特征。后来，Oliveira和Pijoan（2004）通过全菌蛋白组分计算机分析证实了这些发现。

    副猪嗜血杆菌的另一个毒力因子可能是神经氨酸酶。Lichtensteiger和Vimr（1997）发现，90％以上野毒株产生神经氨酸酶。该酶在本菌的对数生长期末期开始表达。神经氨酸酶的作用是通过酶解而暴露为本菌定植和侵入宿主细胞所必需的受体。宿主的防御系统也可因降低粘蛋白黏性而遭到破坏。

    与毒力有关的毒素，至今尚未发现。Schaller等（2000）也排除了副猪嗜血杆菌具有产生与胸膜肺炎放线杆菌RTX（Apx）毒素相关的毒素的基因。

    Blackall等（1997）运用多座位酶电泳（multilocus enzyme electrophoresis，MEE）技术试图分析呼吸道以外分离株与呼吸道分离株之间的区别。结果是，他们不仅揭示了不同来源菌株间的巨大不同点，而且发现了同一血清型不同菌株间的巨大差别，研究人员把它们分为2个MEE主群，但是，也没有发现菌株分离部位与MEE群之间的关系。

    Hill等（2003）运用差异RT-PCR技术(differential display RT-PCR)研究了菌株1185（血清5型）的毒力。该菌在与急性病例相似的40℃高温条件下生长后，作者发现有7个基因在表达，它们分别与fadD（脂肪酰基辅酶A合成酶）、apaH（二腺苷四磷酸）、pstI（磷酸转移酶体系酶Ⅰ）、cysK（半胱氨酸合成酶）、StD（Na＋和Cl-依赖离子转运蛋白）、HSPG（哺乳动物基底膜特异的肝素硫化物核芯蛋白前体）和PntB（吡啶核苷转氢酶）基因同源。15个血清型都有相同的表达。它们与毒力因子的关系尚在研究中。

1.5 分子生物学分型

    基因分型的方法已被用于副猪嗜血杆菌菌株的分类。此类方法与血清分型法比较，特征比较明显。通过鉴定菌株DNA图谱后发现，某些DNA图谱可能与毒力有关联，如由全身感染分离到的菌株与非致病性菌株截然不同，前者各菌株间同源性相当高（Oliveira等2003）。

    Smart等（1988）应用限制性内切酶指纹图谱法（REE）研究了SPF猪群和常规猪群副猪嗜血杆菌的分布情况，在绝大部分SPF猪群，都可以发现相似图谱的菌株，而常规猪群菌株的图谱十分复杂。发病场病猪体分离到的菌株，其图谱亦相似，但与同一猪群由健康猪鼻腔分离到的菌株图谱不同。

    基于重复元件的PCR（repetitive element based－PCR，rep-PCR）技术也被用于副猪嗜血杆菌的基因分型。该法先通过ERIC（enterobacterial repetitive intergenic consensus）引物扩增大小不同的DNA片段，再经电泳分离来揭示特异基因组图谱。用这种方法进行分析，即使是相同血清型的菌株也可分辨出不同的DNA图谱。研究发现，能致死病猪的菌株并不多，但它们都具有相似的DNA图谱（Versalovic等,1991,1994；Woods等1993；Rafiee等,2000；Oliveira等,2003）。

    进行副猪嗜血杆菌基因分型的另一种方法是PCR限制性酶切电泳长度多态性试验（PCR－restriction fragment length polymorphism ，RELP）。运用这种方法分析tbpA（一种编码运铁蛋白结合蛋白的基因），从15个血清型的标准菌株分出了12个不同的DNA图谱，其中血清5、12、14和15型标准菌株的限制性多态图谱相同。在鉴定101个野毒株时，发现了33个RELP图谱，其中有10个与标准菌株的相同。未发现血清型和RELP谱型间的相关性（Redondo等，2003)

2  发病机理

    副猪嗜血杆菌最初的定植部位是否就是上呼吸道，迄今尚无定论。Vahle等（1995）经鼻感染5周龄CDCD仔猪，发现接种后36h可从血液、鼻腔和气管内分离到接种物，在肺和血液涂片中不易发现病菌，也没有从扁桃体中分离到。Amano等（1994）用血清1、4和5型菌株经鼻接种于猪后，则从鼻腔和扁桃体中分离到副猪嗜血杆菌。Segales等（1997）报道在气管内接种后，常可从扁桃体和气管拭子中分离到接种物。2001年Kirkwood等则报道了从染猪鼻腔拭子中分离到副猪嗜血杆菌的结果。

    造成副猪嗜血杆菌侵及全身的因子，尚未被大家公认。Vahle等（1997）证明，能从鼻腔中段分离到副猪嗜血杆菌的猪常伴有急性化脓性鼻炎和黏液纤毛细胞（mucocilliary cell）消失。作者还提出，这些粘膜的改变有助于副猪嗜血杆菌的侵入以及到达血流。但是，无论是通过电镜还是通过免疫组化方法，均未能在纤毛消失和粘膜细胞变性的部位找到副猪嗜血杆菌。

    Brockmeier（2004）证明，支气管败血波氏杆菌（B.bronchiseptica）是造成副猪嗜血杆菌在上呼吸道定植的诱因，其情形与猪萎缩性鼻炎中多杀性巴氏杆菌的作用相似。

3  流行病学

    副猪嗜血杆菌感染呈地方性流行。主要通过直接接触传播。多是因从感染性猪群引进带菌猪而带进致病性菌株。各年龄猪均易感染，都可爆发本病。同样，一旦抗原性不同的新的强毒菌株侵入猪群，也可以引起疫病爆发（Oliveira和Pijoan，2002）。

    在感染性猪群中，母猪是病菌的储主，无论是致病性还是非致病性菌株，仔猪都是在哺乳期被感染的。但是事实上，母猪的带菌率并不高，因此被感染的仔猪也只是一小部分。被感染的小猪可因感染而产生免疫力，但以后也可能成为亚临床带菌猪。未被致病性菌株感染的仔猪，可从母源抗体获得保护。到5~6周龄断奶时，母源抗体水平下降，可因断奶因素的影响而致使亚临床带菌猪数量增加，那些在哺乳期没有接触过致病性菌株的猪只开始发病。因此，本病的临床症状通常在5~6周龄时即断奶之后出现。