枯草芽孢杆菌发酵产物有效磷变化及常规营养成分的评定

　

　　我国是产棉大国，年产棉籽800余万吨，榨油后可以生产出棉籽饼粕约400万吨。新疆作为我国最大的棉花生产基地，其棉花产量约占全国产量的1/3。棉籽饼粕是棉花加工业的主要副产品，富含蛋白质（30%～45%），是重要的蛋白饲料资源，2007年新疆总产量高达140多万吨。棉籽饼粕中不仅含有大量的游离棉酚和环丙烯脂肪酸，还含有植酸等抗营养因子，限制了棉粕在饲料生产中的广泛应用。

　　植酸盐是棉籽饼粕饲料的抗营养因子，其含量约占棉粕干物质的0.84%，植酸的存在会对棉籽饼粕作为饲料的生物学效价产生一定的影响力。植酸会对动物在自身所必需的矿物质吸收利用上产生一系列的阻碍作用，例如引发动物厌食、消瘦和生长缓慢等病症；棉籽中的植酸减少了有效磷的利用率；植酸还会影响动物对蛋白质的消化利用。饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

　　枯草芽孢杆菌是我国农业部公告（第1126号）公布的直接饲喂动物的一种微生态有益菌种，在其生长繁殖过程中可产生植酸酶；玉米是重要的粮食作物和饲料来源，也是全世界总产量最高的粮食作物。研究以产植酸酶枯草芽孢杆菌为菌种，以玉米和棉粕组成的棉粕源生物发酵饲料进行发酵，探究其对棉粕源发酵饲料中有效磷及常规营养成分的影响，为开发棉粕源枯草芽孢杆菌发酵饲料，微生态发酵饲料的科学评定和合理利用提供理论依据；为促进动物生长、生物发酵饲料的科学利用、提高饲料的利用率等提供理论支撑。

　　1　材料与方法

　　棉粕、玉米粉均由新疆石河子天康饲料有限公司提供，粉碎，过60目筛。

　　1.2　菌种及培养基

　　1.2.1　菌种

　　产植酸酶枯草芽孢杆菌Z3由新疆石河子大学动物营养实验室选育。

　　1.2.2　营养琼脂培养基

　　蛋白胨10gL-1、牛肉膏3gL-1、NaCl5gL-1、琼脂15gL-1。pH7.0，121℃条件下高压15min。以下培养基均做同样处理。用于菌株纯化、平板计数。

　　1.2.3　植酸酶液体培养基

　　取经过60目筛粉碎过的麸皮100g加到900mL水中，121℃处理60min，8层纱布过滤，滤液定容至1L，加入胰蛋白胨10g、（NH4）2SO40.4g、MgSO47H2O0.2g、KH2PO40.05g、K2HPO40.04g、CaCl22g，pH7.0。

　　1.3　种子液培养

　　将枯草芽孢杆菌Z3接入营养琼脂培养基，37℃培养24h，挑取1环菌苔接入20mL（50mL三角瓶）植酸酶液体培养基，37℃、200rpm摇动培养15h（一级菌种），取一级菌种1mL接入（150mL三角瓶）WBE培养基50mL，37℃、200rpm摇动培养15h（二级菌种）。

　　1.4　主要仪器和试剂

　　高压蒸汽灭菌锅（MLS-3750，日本）；电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9246MBE，上海）；电热恒温水浴锅（DKB-501A，上海）；722型可见光分光光度计；离心机（日立HITACHI），隔水式恒温培养箱，HH型电热恒温水浴锅。Folin酚试剂、碳酸钠溶液0.4mol、三氯乙酸（TCA）溶液0.4mol、pH7.2磷酸盐缓冲液、酪蛋白2%溶液、酪氨酸溶液100gmL-1，均按SB/T1031721999配制。

　　1.5　试验方法

　　1.5.1　底物发酵处理方法

　　试验组底物处理：将棉粕90g、玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均匀，然后加入蒸馏水30mL，充分搅拌，在0.056MPa、121℃条件下蒸汽灭菌20min，冷却后于无菌条件下接入产植酸酶枯草芽孢杆菌Z3二级种子液7mL，搅拌均匀，三角瓶四层纱布封口，于恒温培养箱37℃静止培养72h。发酵结束后，将发酵产物放入烘箱中45℃烘干48h，冷却粉碎，过60目筛，装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

　　对照组发酵底物处理：将试验底物加入500mL三角瓶中混合均匀，然后加入蒸馏水30mL，充分搅拌调湿，pH自然，在0.056MPa、121℃条件下蒸汽灭菌20min，冷却后接入液体培养基（不含菌种）7mL，搅拌均匀，不经发酵，直接将其放入烘箱中，45℃烘干48h，冷却粉碎，过60目筛，装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

　　常规营养指标的测定参考杨胜《饲料分析及饲料质量检测技术》。植酸酶活性的测定方法参照GBT：18634-2009进行，并做了适当修改，酶液用pH5.5的乙酸钠缓冲液稀释至103，取1mL于37℃预热5min，加入5mmolL-1植酸钠溶液2mL，37℃反应30min，加入颜色终止液2mL，室温条件下静置10min后，取上清液3mL于415nm处测定OD值。空白对照是将酶液和终止液37℃温浴30min后再加入底物植酸钠。植酸酶活性单位定义为样品在植酸钠浓度为5mmolL-1、温度37℃、pH5.5的条件下，植酸钠中释放1μmolmin-1无机磷为1个植酸酶活性单位（U）。植酸含量的测定参照《三氯化铁比色法测定植酸含量的研究》进行测定。植酸磷含量的测定参照《植物饲料中植酸磷的含量及测定》。蛋白酶活性的测定方法为福林法，参照中华人民共和国专业标准SB/T10317-1999。液化型淀粉酶的活力单位定义为1h内能液化1g淀粉为1g液化型淀粉的酶量，参照冯莉方法。底物中枯草芽孢杆菌含量的测定采用平板计数法。

　　试验数据采用Excel软件，使用SPSS16.0统计软件的One-wayANOVA对数据进行方差分析，选取LSD法进行组间差异的显着性检验，结果以“平均值±标准误”表示。

　　2　结果与分析

　　2.1　发酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢杆菌数量的变化

　　发酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢杆菌菌数的变化见表1。

　　从表1中可以得出，发酵前后植酸及植酸酶含量变化规律为发酵后植酸含量极显着降低了6.84%（P<0.01）。说明产植酸酶枯草芽孢杆菌可以降低发酵棉粕中植酸的含量，但降解量很少，这与植酸酶活性较低有关。饲料中枯草芽孢杆菌数量极显着增加7.98×107cfug-1（p<0.01）。< p="">

　　表1　发酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢杆菌菌数的变化

　　

　　注：同列数据肩标相同字母者表示差异不显着（P>0.05），肩标不同小写字母者表示差异显着（P<0.05），肩标不同大写字母者表示差异极显着（p<0.01）。下表同。< p="">

　　2.2　发酵前后底物中常规营养成分的变化

　　发酵前后底物中常规营养成分的变化见表2。

　　

　　从表2可以看出，发酵后干物质（DM）提高了1.72%（P>0.05），粗蛋白质（CP）显着提高了13.7（P<0.05），粗脂肪（ee）显着提高了2.95（p<0.05），钙（ca）极显着提高了16%（p<0.01），磷（p）极显着提高了31.8%（p<0.01），粗灰分（ash）含量极显着降低了4.30%（p<0.01）。结果表明，枯草芽孢杆菌可显着提高棉粕源饲料中p含量，这与植酸磷的磷被不同程度释放出来，进而提高了饲料中磷含量有关。研究发现发酵后棉粕源生物蛋白饲料的营养价值都有不同程度提高。< p="">

　　2.3　发酵前后底物中总磷、植酸磷及有效磷的变化

　　发酵前后底物中总磷、植酸磷及有效磷的变化见表3。

　　由表3可知，发酵后底物中总磷极显着的提高（P<0.01），植酸磷含量显着降低6.4%（P<0.05），有效磷含量极显着提高45.5%（P<0.01），植酸磷/总磷显着降低13.2%（P<0.05），表明枯草芽孢杆菌发酵所产生的植酸酶可以有效的降解棉粕源饲料中的抗营养因子植酸及其盐类（植酸磷），提高棉粕源饲料中有效磷的含量。< p="">

　　表3　发酵前后底物中总磷、植酸磷及有效磷的变化

　　

　　2.4　发酵前后底物中酶活性的变化

　　发酵产物中植酸酶活性提高103.72Ug-1，淀粉酶提高24.43Ug-1，蛋白酶活性提高23.21Ug-1，差异均极显着（P<0.01）。< p="">

　　3　讨论

　　利用微生物发酵法发酵棉粕源饲料，不但可以除去棉粕中的植酸，而且还可以提高棉粕饲料的营养价值，改善棉粕源饲料蛋白质品质，同时可以产生多种消化酶及提高发酵产物的菌群数量，对提高棉粕源饲料的综合利用价值具有重要意义。

　　3.1　微生物发酵棉粕源饲料后常规营养成分的变化

　　微生物在发酵中大量繁殖，可将底物中非蛋白氮、无机氮、碳及抗营养子等转化为营养价值高的菌体蛋白。张庆华等用热带假丝酵母菌CA61、拟内孢霉菌E02和植物乳杆菌3种菌株混合固态发酵棉粕后，粗蛋白质含量从30.05%提高到34.50%，棉粕外观蓬松变软，气味芳香。吴伟伟等研究黑曲霉与酿酒酵母混合固态发酵棉籽饼粕，真蛋白质含量从32.99%提高到42.40%。肖永友等用经驯化后的酵母菌Y-619对发酵棉粕源饲料，发酵后真蛋白质含量提高3.10%。院江等利用由乳酸菌与酵母菌等主要有益菌组成的复合菌发酵棉籽壳，CP提高2.29%，中性洗涤纤维（NDF）降低18.21%，酸性洗涤纤维（ADF）降低16.04%，棉籽壳营养价值显着提高。张文举等研究表明，利用热带假丝酵母菌ZD-3、黑曲霉菌ZD-8对棉籽饼进行复合固体发酵，棉籽饼底物粗蛋白质提高27.83%，粗纤维含量有所降低，其中假丝酵母菌株发酵棉籽饼，可显着降低底物中的EE含量（P<0.05）。< p="">

　　本试验以枯草芽孢杆菌发酵棉粕源生物饲料，CP提高13.7%，主要原因是微生物生长繁殖过程中消耗底物而导致发酵物的绝对含量减少和微生物利用非蛋白氮合成菌体蛋白，从而提高发酵产物中粗蛋白质含量。棉籽饼底物经枯草芽孢杆菌发酵后，其EE含量提高2.95%，说明在发酵过程中枯草芽孢杆菌合成一定量的EE。

　　3.2　微生物发酵棉粕源饲料后酶类、益生菌等含量的变化

　　枯草芽孢杆菌株在其生长繁殖过程中能够产生淀粉酶、植酸酶、纤维素酶和少量脂肪酶等酶类。金红春研究证实，棉粕经过发酵后，淀粉酶活力提高766Ug-1、纤维素酶活力提高494Ug-1、脂肪酶活力提高249Ug-1。徐晶研究发现，发酵后棉粕中蛋白酶含量为664.17Ug-1，淀粉酶为471.73Ug-1，酵母菌为2×106cfug-1，芽孢杆菌为1.3×108cfug-1。邱良伟研究发现，发酵棉粕中芽抱杆菌和酵母菌总活菌数可达4.6×108cfug-1。夏新成等研究了2株酵母和1株霉菌复合固态发酵对棉籽粕脱毒效果及营养价值的影响，结果表明，蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活力变化显着（P<0.05）。王小磊利用复合菌种对棉粕源饲料进行发酵，发酵后酵母菌活菌数达2.2亿g-1（干基），乳酸菌活菌数达2.3亿g-1（干基），芽孢杆菌达18.4亿g-1（干基）。本试验以枯草芽孢杆菌发酵棉粕源生物饲料，发酵结束后枯草芽孢杆菌菌数提高7.98×107cfug-1，发酵产物中植酸酶、淀粉酶、蛋白酶分别提高103.721ug-1、24.431ug-1、23.21ug-1，差异均极显着（p<0.01）。< p="">

　　3.3　微生物发酵棉粕源饲料后有机磷含量的变化

　　关于利用植酸酶降解棉粕或棉粕源饲料中植酸的报道较少。刘晓侠等利用植酸酶对棉粕进行处理，研究在不同浓度的植酸酶作用下，棉粕中有机磷的转化情况，研究发现，植酸酶能显着降低棉粕中的有机磷含量（P<0.05），提高无机磷的含量，且在1000Ukg-1时植酸酶最为经济有效。曹玲等利用微生物植酸酶分别对3种植物性原料（豆粕、玉米蛋白粉、小麦）进行酶处理，结果表明，植酸酶能够显着降低3种植物性原料中植酸磷的含量（P<0.05），同时提升有效磷的含量，通过对磷当量的分析，以植酸酶组1000Ukg-1最为经济有效。本试验以枯草芽孢杆菌发酵棉粕源饲料，发酵后底物中总磷极显着的提高（P<0.01），植酸磷含量显着降低（P<0.05），有效磷含量极显着的提高（P<0.01），植酸磷/总磷显着降低（P<0.05），表明枯草芽孢杆菌发酵所产生的植酸酶可以有效的降解棉粕源饲料中的抗营养因子植酸及其盐类（植酸磷）。< p="">

　　产植酸酶枯草芽孢杆菌对棉粕源生物饲料进行发酵，发酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash、NDF的含量略有所降低，棉粕源生物蛋白饲料的营养价值都有不同程度的提高；发酵后植酸含量降低，总磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，这与植酸酶活性较低有关；蛋白酶活性较低，这可能与菌株诱变有关。

　　产植酸酶枯草芽孢杆菌对棉粕源生物饲料进行发酵，发酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash含量略有所降低，棉粕源生物蛋白饲料的营养价值都有不同程度的提高；发酵后植酸含量降低，总磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，这与植酸酶活性较低有关；蛋白酶活性较低，这可能与菌株诱变有关。

　　4　结论

　　利用产植酸酶枯草芽孢杆菌对棉粕源生物饲料进行发酵，可有效提高饲料的营养价值，降低底物植酸含量，从而对提高饲料蛋白质及矿物质等营养的利用率、降低植酸磷对环境污染，具有一定的生产意义。