探讨益生素检测方法

　　近年来，随着对环保要求的提高，对抗生素使用的限制，以微生态为主的新一代产品发展迅猛，并正在形成产业。

　　但目前市场上很多益生素产品质量仍不稳定，生产处于复配、仿制阶段，检测手段不够完善，产品的标准和检测方法尚混乱，优秀的检测人员不足，造成市场上益生素产品良莠难辩。因此，我们在此对益生菌的检测方法作一简单探讨，以期能更好的完善益生素的市场。

　　通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放、简便、快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。

　　可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1-5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干，或采用红外线烘干。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在 400℃下进行真空干燥。称干重法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast，ADY）。

　　微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时，可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中，即可随时测定其生长情况，而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计，在波长600nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600。

　　1.4 血球计数板法

　　血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1 mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1mL菌液中所含的菌体数。这种方法简便、直观、快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。血球计数板构造，如图1。计数室构造，如图2。

　　为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。

　　将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。这种计数方法比较粗放，并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

　　对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5mL试样，接种1mL到3组共15支装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

　　1.8 平板菌落计数法

　　这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数，而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养，获得了单克隆。

　　在平板计数法的基础上，发展了小型商品化产品以供快速计数用，形式有小型厚滤纸片、琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基，其中加入活性指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，无色），待蘸取测试菌液后，置密封包装袋中培养。短期培养后，在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落，与标准纸色板上图谱比较，即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确，相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

　　用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品，经丫-叮橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光，活细胞会发橙色荧光，而死细胞则发绿色荧光。

　　1.11 测定含氮量

　　大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母为7.5%，霉菌为6.0%。根据含氮量剩以6.25，即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多，如用硫酸、过氯酸、碘酸、磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合，在CO2气流中加热后产生N2，收集在呼吸计中，用KOH吸去CO2后，即可测出N2的量。

　　1.12 测定含碳量

　　将少量（干重0.2-2.0mg）生物材料混入1mL水或无机缓冲液中，用2mL 2%的K2Cr2O7溶液在100℃下加热30min后冷却。加水稀释至5mL，在580nm的波长下读取吸光光度值，即可推算出生长量。需用试剂做空白对照，用标准样品做标准曲线。

　　1.13 还原糖测定法

　　还原糖通常是指单糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况，常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是，离心发酵液，取上清液，加入斐林试剂，沸水浴煮沸3min，取出加少许盐酸酸化，加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液，继续加Na2S2O3至终点，查表读出还原糖的含量。

　　微生物的检测，其发展方向是快速、准确、简便、自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，正逐步广泛应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如：

　　1、抗干扰培养基和微生物数量快速检测技术相结合 解决了传统微生物检测手段不能解决的难题，为建立一套完整的抗干扰微生物检测系统奠定了坚实的基础。中科院广州分院合作产业处提供的抗干扰微生物培养基、新型生化鉴定管、微生物计数卡、环境质量检测试剂盒等，可方便的用于多项检测。

　　2、BACTOMETER 全自动各类总菌数及快速细菌检测系统 可以数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母和霉菌检测同样高度敏感原理是利用电阻抗法 （IMPEDANCE TECHNOLOGY）将待测样本与培养基置于反应试剂盒内，底部有一对不锈钢电极，测定因微生物生长而产生阻抗改变。如微生物生长时，可将培养基中的大分子营养物经代谢转变为活跃小分子，电阻抗法可测试这种微弱变化，从而比传统平板法更快速监测微生物的存在及数量。测定项目包括总生菌数，酵母菌，大肠杆菌群，霉菌，乳酸菌，嗜热菌，革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌等。

　　益生菌不仅有很多种类（如芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌），其检测方法也是非常之多。对不同的益生素，需要选择适当的方法来检测、计数。

　　目前常用的检测是显微镜直接计数法和平板计数法两种，显微镜直接计数法的最大优点就是快速，而且此方法可以通用，即不同的益生菌种类都可以用同一方法检测其数量；但其也有诸多缺点，如不能区分死菌和活菌，也不能区分形状类似的不同益生菌，故其只能作为一种粗略、简单的方法。而平板计数法却可以克服显微镜计数法的缺点，但其对操作人员素质及操作能力要求都比较高，需要比较专业人员来操作。

　　针对目前选择以平板计数来进行测量益生菌的含量为主，本文也就此方法作一简单探讨。

　　2.1.2 采用玻片直接涂布法，即在洁净的玻片上划1cm2正方形，然后吸取经5～10倍稀释的检样0.01mL涂布在方框内，干燥固定后，先用甲醇处理5min再进行革兰氏染色、镜检，判断大概菌数和菌种，则可预测分离培养应选择的培养基和稀释倍数，如不能判断，即认为每克样品含菌数小于105。

　　根据涂布的预测与产品说明，选择相应的培养基，见表1

　　2.3 检测的操作

　　准确称取益生素样品10g，放入装有90mL无菌水的玻璃瓶中，用手或振荡机振荡20min，静置约20min，即成10-1稀释液；再用10mL无菌吸管，吸取10-1菌液10mL移入装有90mL无菌水的玻璃瓶中，充分震荡，即成10-2稀释液；以此类推，每次更换吸管连续稀释，直到制成适当稀释度的菌悬液。

　　2.3.2 平板接种：

　　用1mL无菌吸管吸取适当稀释度的菌悬液1mL到一个灭菌平皿中，接种好三个平皿，再在培养皿中分别倒入已融化并冷却至45-50℃左右的培养基，盖好盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置37℃下培养48～72h后长出菌落后即可计数。

　　2.4 结果计算及说明：

　　将三个平皿的平均菌落数乘以稀释倍数，即为每g益生素中所含的活菌数（如在10-8有30个菌落，即可计为3.0×109cfu/g或者cfu/mL）。选取菌落数在30-300之间的平皿作为菌落总数测定的标准。

　　3 讨论

　　益生菌菌种的质量是微生态调节剂生产的关键和质量保证，因此在生产前必须作如下鉴定：

　　(1)菌株染色形态与菌落均应具典型特征；

　　(2)生化反应与糖发酵均应符合伯杰氏细菌分类的特征；

　　(3)对于乳酸菌类须测定其代谢产物中的有机酸；

　　(4)血清学检查、凝聚试验，效价不低于原效价的1/2；

　　(5)毒性试验:浓菌液给小白鼠腹腔注射或灌胃试验，小白鼠应无不良反应出现；

　　(6)必要时作遗传学特征的鉴定。

　　此外，我国对微生态调节剂的发展起步较晚，目前尚无统一检测方法，故需不断积累有关资料，通过研究完善和建立切实可行的方法是保证微生态调节剂的生产与质量的必要手段。（作者：肖永友 来源：博仕奥生化研发中心）