制备有机铬添加剂—铬酵母的研究

apple12151007 2011-1-4 15:56

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简介

利用生物合成法制备了一种有机铬含量较高的新型添加剂——铬酵母，并采用分光光度法及透析处理测定了铬酵母中总铬和有机铬的含量，从而确定了铬酵母的最佳制备条件。

制备有机铬添加剂——铬酵母的研究

郝素娥　陈庆峰　刘旭　刘亚斌

　　摘　要　利用生物合成法制备了一种有机铬含量较高的新型添加剂——铬酵母，并采用分光光度法及透析处理测定了铬酵母中总铬和有机铬的含量，从而确定了铬酵母的最佳制备条件为：培养基采用麦芽汁+尿素，培养基中三氯化铬的添加量为1.6 μg。ml－1，啤酒酵母的接种量为3%，培养温度为30 ℃，培养时间为48 h。
　　关键词　铬酵母　有机铬　添加剂
　　1　前言
　　铬是生物体必需的微量营养元素，人体缺铬会产生葡萄糖、脂肪、蛋白质代谢障碍，引起各种疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、冠心病、末梢神经炎、近视眼等，尤其婴儿缺铬易患消瘦性蛋白质营养不良症［1］；动物缺铬表现为胆固醇或血糖升高、生长迟缓、免疫力下降、繁殖能力降低和寿命缩短等，如禽类喂含铬量低于5 μg。kg－1的饲料日粮时，羽毛大量脱落；用低铬日粮喂兔，则母兔产仔率下降；用无铬日粮喂种公牛，精液量大大减少，精子畸形率显著提高。当补铬后，症状消失［2］。
　　在研究铬的补充时，主要有无机铬(常用CrCl3。6H2O、Cr2(SO4)3、Cr(NO3）3）和有机铬(常用烟酸铬、蛋白螯合铬、铬酵母)两种形式。铬的生物活性的发挥需要三价铬，铬主要以Cr3＋构成葡萄耐量因子(GTF)，协助胰岛素作用，影响糖类、脂类、蛋白质和核酸的代谢。铬进入体内，经肠道吸收，在血液里与运送铁的球蛋白结合，而后被运至肝脏及全身。由于不同形式的铬在组织中的结合程度不同，导致吸收率不同，因此铬的吸收与化学结合形式有很大关系，饲料中的总铬含量不能反映可利用铬或铬的营养状况。无机铬不但毒性大，且以极低水平吸收，约为0.4%～3％；有机铬安全性高，且易被吸收，吸收率约为10%～25%［3］。瑞士联邦学院畜牧所Gebert和Wenkin的研究表明，烟酸铬和酵母铬的效果明显好于氯化铬，尤以酵母铬最佳［4］。铬酵母是以生物方法制备的，具有生物活性高、毒性小、生产成本低等特点，可以认为是一种具有较好应用前景的铬的补充物。
　　本文利用生物合成法制备了有机铬含量较高的铬酵母，并对所制备的铬酵母中的总铬和有机铬的含量进行了分析测定，从而确定了制备铬酵母的最佳条件，为铬酵母今后在医药及添加剂领域的应用奠定了必要的基础。
2　实验方法
2.1　铬酵母的制备过程
　　培养基调制→灭菌→滤蛋白→添加氯化铬→灭菌→接种酵母菌→培养→离心→水洗→干燥→粉碎→成品
2.2　铬酵母中总铬及有机铬含量的测定
　　铬(Ⅵ)可与对氨基二乙基苯胺发生氧化反应，生成红色化合物，利用分光光度法可以测定铬酵母中的铬含量，最大吸收波长为540 nm［5,6］。
　　铬酵母经消化进行测定，即为铬酵母中的总铬含量；将铬酵母进行透析处理，使有机铬与无机铬分离，便可测得铬酵母中有机铬的含量。
3　实验结果与讨论
　　在铬酵母的制备过程中，铬酵母中的总铬含量及有机铬含量与培养基的种类、培养基中CrCl3。6H2O的添加量、酵母菌种及其接种量、以及培养温度和培养时间均有关。
3.1　培养基的种类对铬酵母中铬含量的影响
　　文中采用了四种不同的培养基进行实验，实验结果见表1。

表1　培养基对铬酵母中铬含量的影响μg/g

培养基种类

麦芽汁

麦芽汁＋尿素

麦芽汁+葡萄糖

人工培养基

总铬
有机铬

84.28
75.05

124.75
109.36

122.40
101.88

91.65
67.48

　　从表1可以看出，当麦芽汁中添加一定量尿素或葡萄糖时，酵母对培养基的利用率较高，其转化无机铬为有机铬的能力也较强；利用人工培养基(葡萄糖加无机盐等)也可制备铬酵母，但从制备效果和经济效益上考虑，均不如采用天然培养基为好。
3.2　培养基中CrCl3。6H2O添加量对铬酵母中铬含量的影响
　　在铬酵母的制备过程中，对铬酵母中总铬含量及有机铬含量影响最大的因素是培养基中CrCl3。6H2O的添加量。由表2可知，随着培养基中CrCl3。6H2O添加量的增加，铬酵母中的总铬含量及有机铬的含量开始的时候亦呈增加趋势，但达到一定水平后又呈下降趋势。这说明酵母能够利用培养基中的无机铬并将其转化为有机铬，但培养基中无机铬的浓度不能太高，浓度太高时会对酵母的生长产生抑制作用。培养基中CrCl3。6H2O的最佳浓度为1.6　μg。ml－1。

表2　CrCl3。6H2O添加量对铬酵母中铬含量的影响

CrCl3/μg。ml－1

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

总铬/μg。g－1
有机铬/μg。g－1

40.08
28.25

77.64
53.19

113.15
90.92

124.75
109.36

108.76
88.12

89.35
69.87

3.3　酵母菌种及接种量对铬酵母中铬含量的影响
　　分别用面包酵母和啤酒酵母进行实验，在相同的实验条件下，用面包酵母的时候，铬酵母的总铬含量较高，而用啤酒酵母时，虽总铬含量稍低些，但其有机铬含量却较高，因此认为还是啤酒酵母较好些，实验结果见表3。另外，酵母菌的接种量对实验结果也有一定的影响，实验表明，接种量为3%时，效果最好。

表3　酵母菌种对铬酵母中铬含量的影响

酵母菌种

面包酵母

啤酒酵母

总铬/μg。g－1
有机铬/μg。g－1

90.05
67.96

84.28
75.05

3.4　培养温度和培养时间对铬酵母制备的影响
　　培养温度和培养时间对铬酵母中总铬含量及有机铬含量亦有一定的影响。分别进行了培养温度为20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃培养时间为24 h，36 h，48 h，60 h,72 h的实验，结果表明，当培养温度为30 ℃，培养时间为48 h时，铬酵母的制备效果最好。
3.5　铬酵母的红外光谱分析
　　在铬酵母的红外分析谱图上可以看出(图1)，在3 371.37 cm-1，1 654.83 cm－1，1 237.26 cm－1，521.71 cm－1处有较强的吸收峰，它们分别为氨基，碳—碳键，羧基，以及三价铬的吸收峰，且发生了不同程度的移动，这说明在铬酵母中存在着碳—铬键，铬是以有机铬的形式存在的，而且很有可能是以铬氨基酸的形式存在的［7］。由于含铬氨基酸的标准样难以得到，铬酵母中有机铬的准确形式还有待于进一步研究。

　　综上所述，当采用天然培养基麦芽汁，其中加一定量尿素，并添加1.6　μg。ml－1的CrCl3。6H2O，啤洒酵母的接种量为3%，培养温度为30 ℃，培养时间为48 h时，可制得总铬及有机铬含量较高的铬酵母，总铬含量可达124.75　μg。g－1，有机铬含量可达109.36　μg。g－1。
　　铬酵母作为一种生理活性高，毒性小，成本低的有机铬添加剂，其开发生产必将产生巨大的社会效益和经济效益。
作者单位：哈尔滨工业大学应用化学系(150001)

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