体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

(In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test)

1    受试物必备 

    化学鉴定 

    纯度（杂质）

稳定性（包括在饲料、介质及水中的稳定性）

固体的溶解度、熔点、沸点

液体的蒸气压、沸点

气溶胶/颗粒物的大小、形状、分散度 

    pH（必要时） 

    闪点

爆炸性

2    试验目的

2.1    目的和意义

体外染色体畸变试验的目的是检测培养的哺乳动物细胞染色体结构畸变。结构畸变可以分为染色体型和染色单体型。大多数化学致突变物诱导染色单体型突变，但染色体型突变也可发生。多倍体增加可表明受试物可导致染色体数目畸变。但是，本准则不用于检测数目畸变。染色体突变和相关事件是很多人类遗传性疾病的原因，并且有证据表明，引起体细胞癌基因和肿瘤抑制基因改变的染色体畸变和相关事件与人类和试验动物肿瘤发生有关。 体外染色体畸变试验可应用于已建立的细胞系、细胞株或原代细胞培养。细胞的选择是根据培养生长能力，核型的稳定性、染色体数目、染色体畸变的自发频率。

2.2    定义

染色单体型畸变(chromatid-tye aberration)、染色体型畸变(chromosome-type aberration)、内复制（endoreduplication）、裂隙（gap）、数目畸变（numberial aberation)、多倍（polyploidy）、结构畸变（stuctural aberration)。

3    试验原理 
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是利用哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，遗传学终点为染色体畸变。

在有和无代谢活化条件下，细胞培养物暴露于受试物，经过预先确定的时间间隔，以中期相阻断剂（如秋水仙素）处理、收获、染色，以显微镜分析中期相细胞染色体畸变。

4    操作方法和程序 
4.1 准备 
4.1.1细胞 
可利用包括人细胞在内的多种细胞系、细胞株或原代细胞培养，如中国仓鼠成纤维细胞、人或其他哺乳动物的周围血淋巴细胞。

 4.1.2培养基和培养条件

应使用适当的培养基和培养条件（培养皿，CO2浓度，温度和湿度）维持培养物，已确立的细胞系或细胞株应常规核实染色体众数和检测支原体污染，如有污染即不应采用。应了解正常的细胞周期时间和培养条件。

4.1.3培养物准备  
   （1）已建立的细胞系和细胞株：从贮备培养物增殖细胞，接种的密度应使细胞在收获时未达到融合，细胞培养于37℃。 

   （2）淋巴细胞：从健康的个体采得经抗凝剂（如肝素）处理的全血或分离的淋巴细胞，加至含促细胞分裂剂（植物凝集素等）的培养基，并培养于37℃。

4.1.4代谢活化 
应在有或无适当的代谢活化系统条件下，细胞暴露于受试物。最常用的代谢活化系统是以酶诱导剂如Aroclor1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合处理的啮齿类动物肝制备的去线粒体后组分（S9）及辅因子系统。S9在培养液中终浓度范围为1%～10% (V/V)。代谢活化系统的条件可能取决于受试物的类别。如用其他的代谢活化系统，应有适当理由。

4.1.5受试物准备 
固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/ 赋形剂中，在处理细胞前适当稀释。液体受试物可直接加至试验系统和/或于处理前稀释。应该使用新鲜制备的受试物，除非有资料证实贮存的稳定性。

4.2 试验条件

4.2.1溶剂/赋形剂

所用溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应，并且应对细菌存活率和S9活性无影响。如果采用不常用的溶剂/赋形剂，应有资料表明其对细菌存活率和S9活性无影响。推荐采用水作溶液剂/赋形剂，当受试物为水不溶性，则所用的有机溶剂应该是无水的。可加入分子筛去除水。 

 4.2.2染毒浓度 

   （1）在决定最高浓度时应考虑受试物的细胞毒性，在试验系统中的溶解性和对pH或渗透压的影响。

   （2）可进行预试验，在无代谢活化条件下利用细胞完整性和细胞生长（如融合程度、存活细胞计数或有丝分裂指数）等指标来确定细胞毒性，并确定溶解性。 

   （3）至少应设置3个浓度组，组间距为2～10倍。在有细胞毒性时，浓度范围应包括最大细胞毒性至几乎无细胞毒性。在收获时最高浓度组应有融合程度、细胞计数或有丝分裂指数降低大于50%。细胞周期动力学资料如平均传代时间（AGT）可用于作为确定染毒浓度的补充资料。对于相对无细胞毒性的化学物，最高浓度应该是5μl/ml，5mg/ml或0.01mol/L，取最低的一种。 

   （4）无细胞毒性的相对不溶的受试物，所用的最高剂量应在染毒期末终培养液中有可见沉淀。应在染毒开始和结束时评价溶解性，因为在试验系统中存在细胞、S9、血清等，在染毒过程中溶解性可能改变。不溶性指肉眼可见的沉淀。沉淀不应干扰结果计数。

4.2.3对照  
   （1）每个试验应包括在有和无代谢活化条件下同时进行的阳性和阴性（溶剂/赋形剂）对照。在利用代谢活化时，阳性对照应是需要代谢活化才显示致突变作用的化学物。 
   （2）阳性对照物（已知的断裂剂）应有超过本底值的可重复的增加，以证实试验系统的敏感性。但阳性对照物的浓度不应使读片者立即发现其为阳性对照标本片。阳性对照物包括（如下表）： 

   （3）也可利用其他适当的阳性对照物。如有可能，应利用与受试物化学结构相关的阳性对照物。

   （4）在每个收获时间都应包括相应的阴性对照。阴性对照在处理培养液中含溶剂/赋形剂，并以同样的方法处置培养物。而且，也应该有未染毒对照，除本底对照资料证明，所选用的溶剂无细胞毒性或致突变作用。 
代谢活化条件    化学物CAS号 
不需要外源性代谢活化    甲磺酸甲酯 (methyl methanesulphonate)[66-27-3] 
甲磺酸乙酯 (ethyl methanesulphonate)[62-50-0]

丝裂霉素c (mitomycin c)[50-07-7]

乙基亚硝基脲 (ethyl nitrosourea)[759-73-9]

4-硝基喹啉-n-氧化物[56-57-5]

需外源性代谢活化    苯并(a)芘 (benzo(a)pyrene)[50-32-8] 
环磷酰胺 (cyclophosphamide)[59-18-0]( monohydrate，单水合物[6055-19-2]) 
4.3 操作方法

4.3.1受试物处理 

   （1）在有和无代谢活化系统条件下，以受试物染毒正在增殖期的细胞。淋巴细胞应在有丝分裂刺激后的48h开始染毒。

   （2）一般对每个浓度和阴性/溶剂对照应该用双份培养物。当本底资料可以证明双份培养物之间变异很小时，对每个浓度仅用1个培养物也可以接受。

   （3）气态或挥发性物质应以适当的方法试验，如用密闭的培养瓶。

4.3.2收获时间

在第一次试验，细胞应在有和无代活化条件下染毒3—6h，并在染毒开始后约1.5倍的正常细胞周期时采样。如此方案在有或无代谢活化均为阴性结果，应再进行一次无代谢活化的试验，延长染毒时间直到采样时。某些化学物在染毒/采样时间长于1.5倍正常细胞周期时更易检测。在有代谢活化条件下得到阴性结果，需要根据情况予以证实。如认为阴性结果不必进行证实，应提供适当理由。

4.3.3染色体制备

在收获前以秋水仙素或秋水仙碱处理细胞培养物1—3h。各个细胞培养物分别收获和低渗、固定和染色，以制备染色体。

4.3.4染色体分析 

   （1）包括阳性和阴性对照的所有的涂片应在显微镜分析之前独立编号。每个浓度组和对照组至少计数200个分散良好的中期相细胞（如果可行，2个平行培养物每个各100个）。计数的细胞含着丝粒数应等于所用细胞染色体众数±2当观察的畸变数很高，计数的中期相数可以减少。

   （2）虽然此试验的目的是检测染色体结构畸变，但应同时观察和记录多倍体和内复制。

5    资料和报告

5.1    数据处理

   （1）试验单位是细胞，应评价有染色体结构畸变细胞百分率。对染毒组和对照组应列出不同类型染色体结构畸变的类型及其数目和频率。应分别记录裂隙，但报告时，一般不包括在总畸变频率中。 

   （2）应记录同时进行的所有染毒组和阴性对照组细胞毒性结果。 

   （3）应提供各个培养物的资料，而且以表格总结所有的资料。 

   （4）明确的阳性结果不要求证实。可疑的结果应进一步试验，最好改变试验条件。对阴性结果应该证实，已如上述。在进一步试验中应考虑改变试验参数，包括改变浓度间距和代谢活化条件。 

5.2    结果和评价和解释  
   （1）判断阳性结果的标准为染色体畸变细胞数有浓度相关性增加和/或在一个或多个浓度有可重复的增加。应首先考虑结果的生物学重要性。统计学方法可利用，以有助于评价试验结果。但是，统计学显著性不应是确定阳性反应的唯一因素。 

   （2）多倍体的细胞数增加可能表明受试物能抑制有丝分裂过程和诱导染色体数目畸变，内复制的细胞数增加可能表明受试物抑制细胞周期进展。 

   （3）结果不符合上述标准的受试物可认为在本系统为阴性结果。 

   （4）虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，在少见的情况下，所得到的资料不能对受试物的致突变性进行明确的判断。经多次重复试验，结果仍然是可疑的。 

   （5）体外染色畸变试验的阳性结果表明受试物培养的哺乳动物体细胞诱导染色体畸变。阴性结果表明在试验条件下受试物对培养的哺乳动物体细胞不诱发染色体畸变。

5.3    试验报告

试验报告必须包括下列信息 

   （1）受试物：鉴定资料和CAS编号（如已知）；理化特性和纯度；受试物的稳定性（如已知）。 

   （2）溶剂/赋形剂：溶剂/赋形剂选择依据；受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。

   （3）细胞：细胞种类和来源；核型特征和所用细胞种类的理由；无支原体污染（如有资料）；细胞周期时间；供血者性别，全血或分离淋巴细胞，所用有丝分裂原；细胞代数（如适用）；细胞维持方法（如适用）；染色体众数。 

   （4）试验条件：中期相阻断剂名称、浓度和细胞染毒时间；选择受试物浓度和培养物数的理由，如细胞毒性资料和溶解性资料（如有资料）；培养基成分和CO2浓度（如适用）；受试物浓度；所加溶剂和赋形剂容积；培养温度；培养时间；染毒时限；接种的细胞密度（如适用）；代谢活化系统的类型和成分，包括合格标准；同时进行的阳性和阴性的对照；制片方法；计数畸变的标准；分析的中期相细胞数；测定细胞毒性的方法；判断试验结果为阳性、阴性或可疑的标准。

   （5）结果：毒性表现，如融合程度，细胞周期资料，细胞计数，有丝分裂指数；出现沉淀的表现；培养液pH和渗透压资料（如测定）；畸变的定义，包括裂隙；对每个处理的和对照的培养物应分别提供有染色体畸变的细胞数，染色体畸变的类型；倍性的改变（如观察到）；剂量-反应关系（如可能）；统计学分析（如进行）；同时进行的阴性（溶剂/赋形剂）和阳性对照资料；历史性对照资料，包括范围、均数和标准差。 

   （6）结果的讨论。 

   （7）结论

6    试验的解释和评价 

   （1）体外试验一般需要利用外源性代谢活化。此代谢活化系统不可能完全模拟哺乳动物体内条件。应注意避免不反映致突变性的假阳性结果，此可能由于pH、渗透性或高度细胞毒性所致。  
   （2）此试验用于筛选可能的哺乳动物致突变物和致癌物。在此试验为阳性的很多化学物是哺乳动物致癌物；但本试验和致癌性之间并无很好的的相关。相关性取决于化学物类别，已且有证据表明此试验未检出的致癌物并不是通过直接损伤DNA的机制起作用的。

7    主要参考文献

1 OECD: OECD Guideline For Testing Of Chemicals. 473 In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, 1-6. Paris: OECD & OCED, Adopted: 26 May, 1983.

2 国家环境保护局.化学品测试准则（1990）. 北京: 化学工业出版社, 1990.

3 US EPA, OPPTS. Health Effects Test Guidelines. In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test. 1998

附录

定义 

    染色单体型畸变 (chromatid-type aberration)：显示为单个染色单体断裂或染色单体间断裂和重接的染色体结构损伤。

    染色体型畸变 (chromosome-type aberration)：显示为两个染色单体在同一部位断裂或断裂和重接的染色体结构损伤。

    内复制 (endoreduplication)：在DNA复制的S期后，细胞核并不进入有丝分裂期，而开始另一个S期的过程。结果是染色体含4、8、16 … 个染色单体。 

    裂隙 (gap)：小于染色单体宽度的不着色的损伤，并伴有染色单体极小的非直线化。 

    数目畸变 (numberial abrration：染色体数目改变，不同于所用动物或细胞染色体的正常数目。 

    多倍体 (polyploidy)：多个单倍体（n）数，但不是二倍体，即3n、4n等。

结构畸变 (structural aberration)：可由显微镜检查在细胞分裂中期相检测到期的染色体结构改变，可见缺失和断裂，内交换或间交换。

重要中英文术语对照

染色单体型畸变（chromatid-tye aberration） 
染色体型畸变（chromosome-type aberration）

内复制（endoreduplication）
裂隙（gap）

数目畸变（numberial aberation） 

多倍（polyploidy） 结构畸变（stuctural aberration）