关于饲用酶制剂活性测定影响因素的分析

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　　关于饲用酶制剂活性测定影响因素的分析
　　摘 要：随着饲用酶制剂的广泛应用，酶活的测定在饲用酶制剂产品的质量检验、产品标签和酶活保证方面变的必不可少。本文就影响饲用酶制剂活性测定的温度、PH、作用时间、底物四大要素及非定义要素酶液稀释度、标准曲线、显色剂、缓冲液进行了总结分析，以便为广大酶制剂工作者正确的应用酶制剂提供参考。
　　关键词：酶制剂;酶活;测定;影响因素
　　饲用酶制剂是工业酶制剂的一个方面，饲用酶的使用已经有50多年的历史，但饲用酶制剂的快速发展期却只是在最近的10～15年时间。近年来，随着生物技术的发展，酶制剂的生产成本的日渐下降，越来越多的酶制剂被应用在饲料工业中，发展到当前已经形成了庞大的饲用酶制剂市场，其中常用的饲料酶制剂主要有植酸酶、淀粉酶、蛋白酶和非淀粉多糖酶四大类。而随着酶制剂生产发展的需要，酶制剂的检测显的越来越重要。经过科研工作者多年的艰苦努力，我国饲料工业标准中已经确立了植酸酶、纤维素酶、β—葡聚糖酶的测定方法。另外，许多企事业单位为了生产研究的需要也制定了很多用于各种酶制剂活力的测定方法。
　　但是以化学方法检测酶制剂的活性时存在许多变异因素，这些因素对不同酶制剂的影响不是平行和同步的，我们需要对酶制剂活性的检测方法和检测过程有一个正确的理解。因此，本文就饲用酶制剂活性测定影响因素进行了总结分析，以便为广大酶制剂工作者正确的应用酶制剂提供参考。
　　1 影响饲用酶制剂活性测定的四大要素分析
　　所谓的酶活性都是指在特定的系统和条件下测到的反应速度。为了确保酶制剂测定结果的一致性，饲用酶制剂活性单位定义中对影响酶活大小的主要条件进行了规定，其中包括温度、pH值、时间和底物，这些都是酶活力测定系统中最重要的因素，对酶促反应速度影响很大。
　　1.1 温度对酶活测定的影响
　　酶制剂对温度非常敏感，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要。温度对酶活性影响主要表现在两个方面，一方面是当温度升高时，酶与底物的反应速率加快;另一方面由于随着温度的升高将使酶的稳定性下降，部分酶蛋白分子逐渐变性而失去活性，引起酶反应速率下降;温度的这两种影响的综合作用而产生酶反应的“最适温度”。对于不同的酶制剂在不同的情况下最适温度是有一定的差别。研究木聚糖酶时发现，在30～40℃条件下酶活较稳定，50℃后随着温度的升高，酶活力开始下降，90℃时基本失活(李卫芬等，1999)。研究纤维素酶最适酶解条件时发现，在36～58℃之间纤维素酶相对酶活随着温度升高而升高，当温度在58～62℃之间时，相对酶活性没有明显变化，曲线近似呈水平状态，在40℃、45℃、50℃条件下，其相对酶活分别为56%、70%、80%，而当温度大于58℃以上时相对酶活不再升高(王琳等，1998)。同时，酶在不同条件下适宜温度也可能要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂以及酶促反应时间等因素的影响。
　　1.2 pH对酶活测定的影响
　　pH值在酶活测定时对测定结果影响很大，各种酶制剂在一定条件下都有其特定的最适酶解pH，酶的最适pH会随着底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适pH也只有在一定条件下才有意义。pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面：1、过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，也影响酶活性部位催化基团和结合基团的解离状态，酶活性丧失;2、当pH改变不是很剧烈时，酶虽未变性，但酶活受到了影响。pH影响了底物的解离状态，或者使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物。pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低可能影响到中间络合的解离状态，不利于酶解生成产物;3、pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性;4、pH影响底物的带电状态。这些都直接影响酶和底物的亲和力，影响酶解反应速度(王静，2003;李险峰，2000)。文献报道，很多酶的最适酶解pH都在3.0～6.0之间(NAKAMURA, T. 1997)。研究不同pH值对嗜热毛壳菌木聚糖酶活性的影响发现，在pH值3.6以前，随着pH值的增大，木聚糖酶的活性逐渐升高;pH值为3.6时，木聚糖酶的活性最高，且在3.2~4.4范围内木聚糖酶的活性维持较高浓度，维持嗜热毛壳菌木聚糖酶活性的适宜的pH值范围应为3.2~4.4(王爱娜等，2006)。杨会涛等(2006)研究pH对木聚糖酶活性影响的结果表明，该酶的最适反应pH为6.0。洪枫等(2000)在研究木聚糖酶最适pH值时指出，里氏木霉RutC-30合成的木聚糖酶最适pH值范围在4.0～5.0之间，pH值对木聚糖酶的酶活影响很大。
　　1.3 作用时间对酶活测定的影响
　　酶催化反应的动力学表明，酶解是一个有一定时间差的过程，当酶解产物达到一定浓度后会对酶产生反馈抑制作用，因而反应速度随着时间延长会越来越慢，所以酶解并非酶解时间是越长越好。测定木聚糖酶酶促反应开始至30 min内的产物生成量，结果表明13 min内产物的吸光度随反应时间几乎呈线性增长，其斜率可以代表酶促反应的初速度，此后速度减慢(单位时间内产生的还原糖量呈下降趋势)，相对酶活逐渐降低(费笛波等，2004)。用DNS法测定纤维素酶活时反应1min后，酶作用底物产生的还原糖量随时间延长呈直线上升，5min后还原糖量的增加变得比较缓慢，10min后，曲线呈现水平状态，还原糖量不再增加，往后随着时间的延长相对酶活逐渐降低(王琳等，1998)。
　　1.4 底物对酶活测定的影响
　　底物的选择对酶活的测定影响也很大。米氏方程表达了酶反应速度与底物浓度之间的定量关系，其反应方程式可表示为：E+S←→ES→P+E，首先酶(E)和底物(S)作用形成中间产物(ES)，然后形成产物(P)并释放出酶(E)。在此平衡反应中，底物(S)的浓度将影响反应速度。当底物浓度较低时，底物浓度与酶活性成正比关系;当底物浓度增加到一定浓度时，酶活将趋于一个极限值，这时酶已被底物所饱和，所以在测定酶活时，底物浓度应大于这个极限值，这样酶活性直接正比于酶浓度而与底物浓度无关，否则会极大地影响测定结果。研究底物浓度对木聚糖酶活性测定的影响结果表明：底物浓度对测定结果有较大影响，底物浓度越高，测定结果也越高;底物浓度在0.006～0.032g/ml时，酶活性的升高与底物浓度呈显著正相关;当底物浓度升高到0.032g/ml以上时，酶活性随底物浓度的升高幅度趋缓(聂国兴等，2002)。研究底物对纤维素酶活性测定影响的结果表明，以Sigma产C5678为底物，纤维素酶活性测定值明显高于上海产的羧甲基纤维素钠测定值，且C5678浓度大于3%后，其浓度对纤维素酶活性测定值无明显影响(顾赛红等，2006)。
　　2 影响饲用酶制剂活性测定的非定义要素分析
　　在进行酶制剂的检测过程中，除了以上分析的几点酶活定义中规定影响饲用酶制剂测定结果的因素外，酶活测定方法中还存在许多对酶活测定结果影响很大的非定义因素，这其中包括样品酶的稀释度、标准曲线的制作、显色剂的配置、缓冲液的离子强度等。
　　2.1 酶液稀释度对酶活测定的影响
　　测定酶样时进行稀释可能带来两种效应，一是影响酶的稳定性，二是降低样品中原有抑制因素和辅助因素的浓度。目前测定酶活的方法通常是先把酶稀释，然后测定稀释酶的活力，所得到的结果乘以稀释倍数即为原酶的活力。但是，事实上许多酶的活力和稀释倍数并不成比例关系。据陆文清、李德发分析(2002)，选择酶样的稀释倍数实质上是选择酶分子与底物分子之间的数量比例，二者的比例只有在适当的范围内时酶蛋白的活力才与产物的生成量呈线性正比例关系。酶样稀释倍数过大会影响酶活的稳定性，稀释倍数不同最终获得的酶活测定值有很大差异(顾赛红等，2006)。费笛波等(2004)为探讨稀释率对木聚糖酶测定结果的影响，将酶样稀释度从1000倍升至11000倍，结果表明，稀释度的改变，明显影响酶活力测定结果，稀释度低，因吸光值太大使结果大大偏低;但稀释度过大因A值过小，结果也偏低。因此，测定时应规定合理的吸光值范围(以0.2～0.5为宜)，以获得相对稳定的测定结果。
　　2.2 标准曲线对酶活测定的影响
　　标准曲线是酶制剂检测过程中能求出检测值的唯一对照依据，曲线方程的大小直接影响着换算出来的测定值。为了减少系统误差给测定带来的影响，标准曲线制作时应尽可能和样品在同一条件下反应。标准曲线的制作一般可以采用相对法和绝对法两种形式，相对法是借助已知准确含量的酶标准对照品作标准曲线，绝对法则是用一些酶活定义中规定的反应产物来衡量酶解产物作标准曲线。相对于绝对法，相对法测定结果精度高，速度快，费用低。分析来自不同实验室的测定结果表明，两种方法的精确度有近3倍的差异(张若寒，2001)。绝对法适用于法定的质量认证及仲裁机构，为一般单位常规测定提供基准物质，相对法适用于一般有日常测定需要的机构或企业。
　　2.3 显色剂的配置对酶活测定的影响
　　在酶制剂检测反应的最后都要对反应产物进行显色，并用不同的方式对比产物生成的量，一般应用分光光度计法较多，也有用滴定法等其它方法。其中，显色剂类型的不同、相同显色剂但其中物质配比的不同、显色剂在反应中添加量的不同以及显色时间的不同，都会产生不同的反应结果，对酶活检测的值也会产生一定的影响。植酸酶酶活测定的机理都是利用酶水解植酸钠底物形成无机磷，然后测定无机磷的释放量，采用四种显色方法对比测定植酸酶反应产生的无机磷，分别是：丙酮—磷钼酸铵法、钒—钼酸铵法、维生素C —钼蓝法、钼蓝法，对比结果表明，丙酮—磷钼酸铵法较其他三种方法更具有优势(黄遵锡等，1999)。聂国兴(2002)研究了DNS量对木聚糖酶活性测定的影响，结果表明：由于DNS用量变化，测定结果也发生了明显变化，DNS用量在3ml时测得的酶活最高。王琳等(1998)研究DNS法测定纤维素酶活力最适条件，结果表明DNS显色5分钟比较适宜。
　　2.4 缓冲液的离子强度对酶活测定的影响
　　反应体系中缓冲液的离子强度影响酶制剂的蛋白空间结构，从而影响其催化能力。所以，测定酶活时应尽可能统一反应缓冲液的种类和离子强度。研究植酸酶测定所用缓冲液时发现，使用柠檬酸缓冲液测定商业植酸酶(真菌植酸酶和细菌植酸酶)的酶活仅相对于使用乙酸缓冲液的65～70%(Nelson E. Ward等，2007)。Dalsgaard等(2007)发现，用柠檬酸缓冲液检测两种大肠杆菌植酸酶的酶活只相当于用乙酸缓冲液得到的酶活的三分之一。
　　3 结 语
　　酶活的测定在饲用酶制剂产品的质量检验、产品标签和酶活保证方面是必不可少的。酶活测定是一种非常细致的工作，以上分析了一些影响酶制剂检测的主要影响因素，但在酶制剂检测的过程中，有些细节问题对酶制剂检测也会产生一定的影响，比如：一些操作细节、离心速度、摇匀力度和次数、搅拌时间、移液器的正确使用以及玻璃仪器的清洁度等。这些细节可能不是酶制剂研究工作者非常关注和研究的焦点，但对一些性质不稳定的酶制剂进行检测时，这些细节问题的疏忽也会对结果产生较大的影响。所以，在饲用酶制剂酶活检测过程中，我们不但要理解影响酶制剂酶活测定的主要因素，正确把握各影响因素的关键点，对于一些其它的细小影响因素也不能掉以轻心，尽量把酶制剂检测过程中每一个要点和步骤做好。

lilyyang

楼主辛苦了。