HPLC法测定饲料中喹乙醇残留及应用

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　　HPLC法测定饲料中喹乙醇残留及应用

　　①刘维华 ①陈 娟 ②张巨顺 ③吴 静

　　宁夏动物食品质量安全检测中心(银川 · 750001)

　　摘要 建立HPLC法测定饲料中喹乙醇的残留，具有很好的分离度，浓度10ug/mL～100ug/mL范围呈良好的线性关系，R=0.99998。回收率范围为85.8%～99.4%，批内变异系数≤5.7%,批间变异系数≤1.1%。检测24批鸡配合料，喹乙醇残留未检出，检测62批鱼饲料，喹乙醇残留检出率为8.1 %，检出的样品中，残留量范围为19.7～42.0mg/kg 。表明鱼饲料中存在喹乙醇残留隐患。
　　关键词 HPLC法 测定 喹乙醇 残留 应用
　　1 前言
　　喹乙醇为喹垩啉类二氧化物。外观为浅黄色结晶性粉末，无臭，味苦，属抗菌药，在饲料中添加可促进畜禽生长。通常与淀粉或麸皮、磷酸氢钙、碳酸钙配制成饲料预混剂来使用。本品对猪的毒性较小，但仔猪超量易中毒，可引起肾小球损害;家禽对本品敏感、安全范围小。残留于动物组织中的喹乙醇以3-甲基喹恶啉-2-羧酸成分存在，它是一种基因毒剂，生殖腺诱变剂，通过食物进入人体，形成残留蓄积，会明显的影响机体的代谢平衡，可引起光敏反应、有致突变、致畸、致癌性，对人体尤其胎儿和儿童发育造成很大的危害。因此，中国兽药典规定，禁用于禽、鱼，体重超过35kg的猪禁用。笔者建立HPLC法测定禽、鱼饲料中喹乙醇的残留，进行了方法学考察并加以应用，现将试验结果汇报如下：
　　2 试验方法
　　2.1 主要仪器
　　Agilent 1100 高效液相色谱仪，配FLD检测器和ALS自动进样器;AM-6型ACE破碎乳化仪(日本精机制作所);高速冷冻离心机(HITACHI)，WSZ-100-A振荡器(上海安亭科学仪器厂);移液器(Fin npipette);微孔滤膜(孔径0.45um);
　　2.2主要试剂
　　喹乙醇：含量99.6%，批号H0060305，中国兽医药品监察所提供;甲醇：色谱纯，
　　乙酸：分析纯，水为去离子水。
　　试料来源：共86份，宁夏饲料生产企业鸡配合料24份，渔塘自配料62份。
　　2.3 色谱条件
　　色谱柱(ZOR BAX Eclipse XDB-C18,4.6×250mm);流动相：15%甲醇，流速：
　　0.9ml/min;柱温：室温;进样量：5μL;检测波长：260 nm。
　　※ ①宁夏动物食品质量安全检测中心②宁夏中卫市饲料工业办公室 ③宁夏农业学校04级毕业生
　　2.4标准溶液的制备
　　精密称取喹乙醇标准品各0.05020g置 50 mL棕色瓶中，用5%甲醇60℃超声水浴溶解并定容。摇匀即得1.0mg/ml喹乙醇标准储备液;
　　精密量取储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，置 100 ml容量瓶中，用5%的甲醇稀释至刻度，得10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ug/ml喹乙醇标准系列工作溶液。
　　2.5试料提取
　　称取饲料试料5.0g，置具塞锥形瓶中，加0.5g碳酸钾和5%的甲醇50ml，具塞置如入摇床200r/min振荡30min，将上清液转入离心管，以10000r/min离心15分钟，取上清液用0.45um滤膜过滤，上机测定。
　　2.6阳性添加试料的制备
　　精密量取喹乙醇标准储备液1.0ml，置于5g空白试样的具塞锥形瓶中，同试料提取方法，得到200mg/kg的阳性添加试料;精密量取喹乙醇标准储备液4.0ml，置于5g空白试样中，制备成800mg/kg的阳性添加试料。
　　2.7计算
　　阳性添加试料回收率计算公式：R=X/X0×100%
　　式中： X：实测添加量(mg/kg);X0：添加量(mg/kg)。
　　残留量X=C·V/m
　　式中X：饲料中喹乙醇的含量;(mg/kg) C：由标准曲线计算所得的样液浓度;(μg/ml)
　　V：稀释体积;V=50(ml)
　　m：供试试料的质量(g)
　　3 试验结果
　　3.1标准曲线
　　在上述色谱条件下测定标准系列溶液，喹乙醇的保留时间8.5～8.8分钟，回归方程为：
　　Y=34.96632X-5.20610 R=0.99998
　　在上述色谱条件下，喹乙醇的峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性范围为10mg/mL～100mg/mL。
　　3.2加标回收率
　　在空白试料中做200mg/kg、800mg/kg两个水平阳性添加，每水平做4份平行样品，每份结果取2针平均值，考察3次。喹乙醇的回收率、批内变异系数、批间变异系数见表1、2。
　　表-1 喹乙醇200mg/kg添加样品结果汇总表

类别		第一批			第二批			第三批
样品编号		称样量（g）	实测浓度（μg/kg）	回收率（%）	称样量（g）	实测浓度（μg/kg）	回收率（%）	称样量（g）	实测浓度 （μg/kg）	回收率（%）
空白		5.00	0		5.00	0		5.00	0
1		5.00	18.5	92.3	5.00	18.5	92.5	5.00	18.9	94.3
2		5.00	18.2	90.9	5.00	18.8	94.0	5.00	18.8	93.8
3		5.00	19.4	96.8	5.00	18.5	92.5	5.00	18.7	93.3
4		5.00	18.5	92.5	5.00	19.3	96.5	5.00	19.9	99.4
平均值			18.6	93.1		18.8	93.9		19.1	95.2
变 异	批内（%）	2.8			2.0			2.8
	批间（%）	1.1
回收率范围		90.9～99.4%

　　表-2 喹乙醇800mg/kg添加样品结果汇总表

类别		第一批			第二批			第三批
样品编号		称样量（g）	实测浓度（μg/kg）	回收率（%）	称样量（g）	实测浓度（μg/kg）	回收率（%）	称样量（g）	实测浓度 （μg/kg）	回收率（%）
空白		5.00	0		5.00	0		5.00	0
1		5.00	73.2	91.2	5.00	68.6	85.8	5.00	72.3	90.4
2		5.00	72.8	91.0	5.00	68.8	86.0	5.00	70.6	88.3
3		5.00	72.7	91.0	5.00	75.8	94.8	5.00	71.5	89.4
4		5.00	72.9	91.1	5.00	75.9	94.9	5.00	71.9	89.9
平均值			72.9	91.1		72.3	90.4		71.6	89.5
变 异	批内（%）	0.30			5.7			1.0
	批间（%）	0.90
回收率范围		85.8～94.9%

　　3.3重复性
　　对不同浓度的溶液室温放置72小时，每天测定其浓度，考察重复性或稳定性。结果见表-3。
　　表-3　 不同浓度喹乙醇溶液72小时峰面积变化情况

浓度（ug/ml）	10.0	20.0	40.0	60.0	80.0	100.0
第一天峰面积	347.30	689.38	1390.97	2092.46	2775.65	3508.29
第二天峰面积	350.55	688.53	1389.16	2093.02	2777.40	3497.36
第三天峰面积	330.22	651.26	1380.07	2092.65	2775.46	3487.55
平均峰面积	342.69	676.39	1386.73	2092.71	2776.17	3497.73
变异系数（%）	3.2	3.2	0.42	0.01	0.04	0.30

　　4应用
　　用本方法对宁夏饲料生产企业鸡配合料24份，渔塘自配料62份进行喹乙醇残留检测，统计结果见表4。
　　表-4 饲料中喹乙醇残留监测结果汇总表

样品来源	抽样数（批）	检出数（批）	检出率 （%）	超标数（批）	超标率（%）
鸡配合饲料	24	0	0	0	0
淡水鱼自配料	62	5	8.1	5	8.1
合 计	86	5	5.8	5	5.8
饲料中喹乙醇残留检出的范围 19.7～ 42.0mg/kg

　　5总结与讨论
　　5.1方法学考察
　　5.1.1标准曲线表明：HPLC法检测喹乙醇的含量在10.0ug/ml～100.0ug/ml范围呈良好线性关系，喹乙醇出峰保留时间为8.5～8.8分钟之间，前后几乎无干扰峰，分离度很好，回归方程相关系数R=0.99998。
　　5.1.2加标回收率试验结果表明：200μg/kg阳性添加，喹乙醇平均回收率94.1%,回收率范围90.9%～99.4%，三次考察批内变异系数分别为2.8%、2.0%、2.8%，批间变异系数为1.1%。800μg/kg阳性添加喹乙醇平均回收率90.3%，回收率范围85.8%～94.9%，三次考察批内变系数为0.3%、5.7%、1.0%，批间变异系数0.9%。综上所述，该方法检测喹乙醇残留，阳性添加回收率范围85.8%～99.4%，批内变异系数≤5.7%,批间≤1.1%。200μg/kg阳性添加的平均回收率高于800μg/kg阳性添加的平均回收率3.8%。
　　5.1.3用5%甲醇配制的喹乙醇标准品溶液，室温放置三日测定结果较为稳定。由表3可得，随着对照溶液浓度的稀释梯度降低，重复测定峰面积的稳定性变差。喹乙醇标准品溶液浓度为60.0μg/ml时，三日重复性最稳定，变异系数为0.01%;喹乙醇标准品溶液浓度10.0μg/ml、20.0μg/ml时，三日重复性最不稳定，变异系数为3.2%。
　　5.2 方法应用及残留隐患分析
　　经过方法学考察的HPLC法，测定鸡配合饲料、鱼饲料中的喹乙醇残留，表4表明。鸡配合饲料中的喹乙醇残留未检出，鱼饲料中的喹乙醇残留检出率为8.1%，检出的样品中残留量范围为19.7mg/kg～42.0mg/kg。说明，为了促进生长，鱼饲料中非法添加喹乙醇的现象存在，这与笔者2006年鱼肉中喹乙醇残留检测的结果是一致的。这就要求渔政管理部门和饲料管理部门应该起抓共管，严厉打击违禁药物的非法使用，确保水产品质量的安全。
　　5.3结论
　　本方法测定饲料中喹乙醇的残留，检测条件稳定，加标回收率高，变异系数较小，可操作性强，应用简单方便。对农产品质量安全检测中心开展养殖业投入品中违禁药物的残留检测工作具有现实指导意义。
　　参考文献
　　[1] 中国兽药典委员会，《兽药使用指南》二○○五年版，中国农业出版社，P90。
　　[2] 农牧发[2007]7号。.
　　[3]刘维华等，《畜产品质量安全检验技术》， 第二章，第十一节，P54。
　　[4] GB/T8381.7-2005《饲料中喹乙醇的测定 高效液相色谱法》。
　　作者简介：刘维华，男，1967年2月出生，1990年西北农业大学兽医系毕业，宁夏回族自治区兽药饲料监察所工作，高级兽医师。从事兽药、饲料、药物残留、食品质量安全检验17年，发表论文30余篇，主编《畜产品质量安全检验技术》20万字，三项科研成果获自治区科技进步二、三等奖。

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好资料，lz好人