Marc-145 DMEM培养基

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　　Marc 145细胞培养和维持有关资料综述
　　一、 细胞及培养
　　1、Marc145细胞
　　上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到，可连续培养。
　　2、生长培养基
　　DMEM(高糖型，含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)+5-10%新生牛血清+ 1%双抗(青霉素和链霉素)的培养液。
　　3、冻存液
　　生长培养基+10% DMSO
　　4、细胞健康生长的几项注意事项
　　(1)细胞没有支原体等外源因子的感染。
　　(2)培养液的pH值可在7.0-7.3，以7.2为佳。
　　(3)一般按1：3传代，细胞接种密度为1-1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。
　　(4)培养基和血清的质量可靠、稳定;建议采用特级小牛血清。
　　(5)细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
　　(6)细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。
　　二、 病毒感染、维持和收获
　　转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3-5天。
　　维持液：DMEM+4～5%新生牛血清。
　　pH应为7.4～7.8;后期维持pH会慢慢降下来。
　　细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80%左右，当细胞出现80%以上病变(CPE)时，即可开始收毒;反复传过几代后病变时间可缩短。
　　第3、4天注意观察，细胞病变(CPE)达到80%时收获病毒，-20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。
　　收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。
　　三、 细胞病变(CPE)
　　细胞在接种病毒后，24-48hr开始出现病变，72-96hr约达到80%病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。
　　四、 PRRS病毒在细胞中增殖规律( Virology Journal, 2006, 3: 90)
　　PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20-22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性(low permissiveness)与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段：感染后的2-3天(也称为病毒的对数感染期)，病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus)，并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。
　　对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell;同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2-4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。

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呵呵，学习了