肽的测定方法

狮山跳蚤

看到很多讨论小肽的测定方法的，这里有个比较准确的方法，希望对各位有帮助！

小小学徒

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狮山跳蚤

饲料中水溶性活性肽含量测定
一、        范围
    本标准规定了饲料中水溶性活性肽含量测定方法。
    本标准适用于饲料原料、配合饲料。检测范围为比色溶液中活性肽含量15mg/ml。
二、        引用标准
       下列标准所包含的条文，通过本标准中引用而构成为本标准的条文，本标准出版时，所示版本均为有效，所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
       GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法
三、        方法原理
先将试样中可溶性蛋白质、游离氨基酸和氨在水中提取出来，部分提取液在110℃，6mol/l盐酸中水解成单个氨基酸，经茚三酮显色反应在570nm处测定总氨基酸氮含量，空白以提取液未水解直接与茚三酮显色反应在570nm处测定的游离氨基酸氮含量，水溶性活性肽含量即是总氨基酸氮含量减去游离氨基酸氮含量。
四、        试剂
本标准所用试剂，出特殊说明外，均为分析纯。
实验室用水应符合GB/T6682中三级水的规格。
4.1  乙酸钠缓冲液4M  PH5.5：称32.8g无水乙酸钠于100ml容量瓶加60ml去离子水，缓慢加热溶解，冷后加10ml冰乙酸，用水定容,贮存备用。
4.2  盐酸（GB622）
4.3  0.1mol/l盐酸：8.3ml盐酸（GB622）注入1000ml水中，贮存备用。
4.4  茚三酮：称1.67g茚三酮(HG3-984-76)于250ml容量瓶，加125ml乙二醇甲基醚（Fisher E182）,加7ml冰乙酸，25ml 4M NaAc缓冲液（4.1），用水定容，该试剂可稳定一年，贮存棕色瓶中。
4.5         硫酸肼：称0.26g硫酸肼（GB698-77）到1升容量瓶，溶于去离子水，加 3-4 滴浓H2SO4,用去离
子水定容，贮存棕瓶可稳定1年。
4.6         三氯乙酸：25g三氯乙酸(HG3-1105-77)于100ml容量瓶中，加水定容。
4.7         氨基酸标准贮备液：（1000mg氨基酸氮/L）
将L-亮氨酸（L-leucine）含氮10.67%在真空干燥皿中50℃ 干燥过夜。称0.937g干燥L-亮氨酸于100ml容量瓶，并用0.1mol/l盐酸（4.3）溶解，并用0.1mol/l盐酸（4.3）定容，此溶液4℃ 下可稳定一个月。
4.8         氨基酸标准工作液：
移2、4、6、8、10ml标准贮备液（4.7）于100ml溶量瓶中，用0.1mol/l盐酸（4.3）定容成20、40、60、80和100mg氨基氮/L,此溶液4℃下可稳定一个月。
五、仪器、设备
5.1        实验室用样品粉碎机
5.2        分析天平
5.3        磁力搅拌器
5.4        涡流混合仪
5.5        离心机
5.6        反应瓶：类似安瓿瓶，能密封
5.7        电热恒温箱：110℃±1℃
5.8        注射过滤器：带0.45μm滤纸
5.9        真空干燥器
5.10        电热恒温水浴：90℃1±1℃
5.11        分光光度计：备1cm比色杯，570nm
六、        试样的制备
选取有代表性的饲料样品，至少500克，用四分法缩减至100克，磨碎，并过0.25mm孔径（60目），充分混均后装入磨口瓶中备用。
七、分析步骤
7.1  提取
称取约2g样品，精确至0.001g于磁力搅拌器（5.3）中加入20ml水，强力快速搅拌2min，用快速滤纸过滤，收集滤过物（置于4℃冰箱中）。
7.2  提纯
取上述提取液（7.1）8ml于离心管中，加2ml  25%三氯乙酸（4.6），并用涡流混合仪（5.4）混均，室温下放置反应1h后，用离心机（5.5）离心2500r×25min，移取上清液于另一试管中备用（或置于4℃冰箱中）。
7.3 水解
取2ml提纯待测液（7.2）于5ml反应瓶中（5.6），加2ml盐酸（4.2）混均、抽真空、冲氮气并密封，于电热恒温箱（5.7）110℃水解24h后，取出冷却至室温；用注射过滤器（5.8）过滤，取滤液1ml于另一个5ml小烧杯中并置于真空干燥器（5.9），抽真空，直到样品完全干燥，再加4ml水溶解烧杯中残渣，待测。
7.4  标准曲线测定
取各个氨基酸标准工作液（4.8）0.2ml， 0.1mol/l盐酸（4.3）0.2ml于20ml比色管中，各加2ml茚三酮溶液（4.5）和10ml硫酸肼溶液（4.4），混均，置于90℃水浴（5.10）15min，取出快速冷却至室温，以盐酸空白比色为参照用1cm比色杯于分光光度计（5.11）570nm处测试吸光度，以氨基酸氮含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
7.5  试样的测定
    准确移取提纯液（7.2）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步骤测定吸光度，从标准曲线（7.4）查得试样提纯液的氨基酸氮含量(a)。
7.6  水解样的测定
     准确移取水解后水溶解样品液（7.3）0.2ml于20ml比色管中，按7.4的方法步骤测定吸光度，从标准曲线（7.4）查得试样水解液的氨基酸氮含量(b)。
八、        定结果的计算
样品中活性肽总氮含量（mg/kg）按下式计算：
水溶性活性肽含量（mg/kg）=（b/m ×mb¬¬¬—a/m×ma ）×3.07

式中：
a   ——由标准曲线查得试样液氨基酸氮含量
b   ——由标准曲线查得水解液氨基酸氮含量
ma  ——试样稀释倍数
mb  ——水解样稀释倍数
m  ——样品的质量
3.07——氮和肽之间的转换系数
九、        允许误差
同一分析者对同一试样两次测定所得结果相对偏差≤10%。

狮山跳蚤 于 2010-7-16 10:23 补充以下内容

能不能贴出来呀，下载还要钱，呵呵
小小学徒 发表于 2010-7-16 10:18

    贴出来了不知道王博士有没意见，以后没人充值了，呵呵

宁静的港湾

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柳粒橙

有好的知识和技术大家一起共享呀，谢谢！