猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的诊断及其分子特点

fcltufh

猪繁殖与呼吸综合征(poreine reproductive andrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(poreine reprOductive and respiratoly syndromevirus，PRRSV)引起猪的一种繁殖和呼吸障碍的传染病，是一种免疫抑制性疾病。以母猪妊娠后期的早产、流产、产弱胎、木乃伊胎，以及仔猪、架子猪肺炎及断奶后死亡率升高为特点。PRRSV属于动脉炎病毒科成员之一，基因组长度约为15 knt，含有8个开放阅读框架(ORFs)，其中ORFla和ORnb约占基因组的80％，主要编码病毒复制酶和聚合酶，与病毒的复制和转录相关；ORFla所编码的寡聚蛋白经加工后成为6种非结构蛋白(NSPld，NSPlp，NSP2-NSP5)，ORFlb被ORFla所编码的蛋白酶切割可形成4个蛋白(RdRp，CP2，CP3，CP4)；ORF2-ORF7编码病毒的结构蛋白GP2、GP3、GP4、GP5(E)、M和N蛋白，GP2—GP5为糖蛋白，M为膜基质蛋白，N为核衣壳蛋白。目前根据基因型和抗原性的差异将PRRSV分为美洲型和欧洲型2种，各自代表株分别为VR-2332株和LV株，NSP2在两型中差异大，推测NSP2的差异可能与病毒株的某种功能有关系。ORF5和NSP2可能代表全基因在遗传学上的可变区，说明PRRSV的病原性非常多变。
    2006年在中国发生PRRS，由南向北波及16个以上省、市、自治区，造成巨大的经济损失。本实验室对北京及其周边地区的来自4个猪场的4头病猪通过流行病学、病理学及病毒比较基因组学的系统研究，现报告如下。
1  材料与方法
1．1  病料与试剂
    病料：4头病死猪(BJSY-1，BJPG，BJSD和BJBLZ)，分别来自于北京及其周边地区4个猪场。
    细胞：Marc—145细胞由本实验室保存。
    试剂：TrizollnvetrogenTM试剂；TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver．3．0试剂盒；TaKaRa Agarose GelDNAPurification KitVer．2．0；含10％新生牛血清的DMEM(GIBCO)的培养液，含2％新生牛血清的DMEM的维持液；氯仿；异丙醇；乙醇，二甲苯，10％中性福尔马林，伊红，苏木素等。
1．2  引物
    根据GenBank中PRRSV美洲株VR-2332(DQl76021)等序列，遵循引物设计原则，利用PrimerPremier5．0，DNAMAN和DNAStar自行设计以下引物(表1)。由上海生工生物技术有限公司合成。
  
1．3  PRRSV参考毒株
    29株毒株及GenBank登录号分别为：欧洲株有Lelystad  virus  (MYPOLYENV)，  Euro  PRRSV(AY366525)，  01CBl  (DQ864705)，  Sml—08(DQ489311)；美洲株有16244B(AF046869)，SP(AFl84212  )，  VR-2332  (  PRU87392  )，  BJ-4(A1331831  )，  CH-1a  (  AY032626  )，  P129(AF494042)，PA8(AFl76348)，HNl(AY457635)，JAl42  (AY424271)，  MLV  (AF066183)，  PL97-1(AY585241)，HB-1(sh)／2002(AYl50312)，HB-2(sh)／2002(AY262352)，MNl84A(DQl76019)，MNl84B(DQl76020)，VR-2332 V7(DQl76021)，LMY(DQ473474)，Prome Pac(DQ779791)，PRRSV(NC  —  001％1)，  HEBl  (EFll2447)，  JXAl(EFll2445)，WUHl(EUl87484)，S1(DQ459471)，SHH(EUl06888)，LN(EUl09502)。
1．4  PRRS的调查与检查
    对PRRS流行病学及临床症状进行调查。
    病理学检查：按常规方法进行尸体剖检，记录眼观病变，采取心脏、肺脏、脾脏、各部位淋巴结、肾脏、肾上腺、胰腺、扁桃体、甲状腺、胃、各段肠道和脑组织。固定于10％的中性福尔马林溶液中，常规石蜡包埋制片，H．E染色。光学显微镜下观察。
    血清学检查：将采集的猪全血，离心8 min，3 000r／min，分离血清。送中国农业部兽医诊断中心采用ELISA进行PRRSV抗体检测。
1．5  PRRSV核酸检测
    剖检时无菌取肺脏、肝脏、淋巴结、脾脏以及脑等放于封口袋中，于-70℃备用。
    RNA的提取：从4个猪场4具尸体肺脏或肝脏，脾脏，淋巴结中提取PRRSV RNA，按Trizol invitro-genTM试剂盒说明书操作。
    RT-PCR反应：按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver．3．0试剂盒说明书操作，检测引物退火温度为50 ℃。
1．6  病毒分离
1．6．1  病抖处理
    单独取一种脏器或混合称取肺脏、脾脏、肝脏和淋巴结，用研磨器研磨，按1：5比例加入PBS(pH7．2)制成匀浆，反复冻融3次，离心10 min，3 800r／min，上清液用0．22／xm微孔滤膜过滤后待接种Marc—145细胞。
1．6．2  病毒的增殖
    将处理好的病料接种形成单层的Marc-145细胞，1 mL／瓶，37℃吸附60min，弃去接种毒液，加入维持液5mL，37℃培养，连续培育观察5d反复冻融3次，收获培养上清液，继续盲传5代。当细胞出现CPE达70％—80％时收毒，分别命名为BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株，-70 ℃保存。
1．7  PRRSV全基因序列测定
1．7．1  PRRSV RNA提取
    从收取的Marc-145细胞毒液中，按Trizolinvitro-senTM试剂盒说明书操作，提取PRRSVRNA。
1．7．2  RT-PCR反应
    按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver．3．0试剂盒说明书操作，退火温度48—58 ℃。
1．7．3  PCR产物纯化和测序
    取60ulpcr产物点样，110 V电泳，回收纯化按照TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer．2．0试剂盒说明书操作，送北京六合通经贸有限公司测序。
1．8  序列分析
    用Primer Premier 5．0，DNAMAN和DNAStar生物学软件将PRRSV各段基因的测序结果拼接，进行序列比对和遗传演化分析。
2  结果与分析
2．1  流行病学调查
    30-60kS的肥猪发病，病程5—15d，调查总体发病率达50％以上，病死率80％以上。4个猪场的具体数据分别为BJSD场49头肥猪全部发病，其中16头死亡，发病率100％，病死率33％；BJPG场400头肥猪近200头发病死亡，仍有不断发病；BJSY-1场肥猪600多头，发病后2 d内死亡250头，死亡率达到42％；BJBLZ场700头肥猪，发病40头，9头死亡，发病率6％以上，病死率23％。
    10％母猪流产，死胎率25％，3％的经产和初产母猪在产仔后死亡。约10％的公猪出现了咳嗽等呼吸道症状。
    仔猪10日龄开始发病，以断奶后到50日龄的发病为多，病程15～20 d，仔猪总体情况为发病率70％以上，病死率90％以上。4个猪场仔猪的发病情况如下：BJSD场100头仔猪几乎全部死亡；BJPG场断奶后的仔猪死亡率高达80％以上；母猪达600头的BJSY-1场仔猪死亡率80％以上；BJBLZ场饲养800多头母猪，经产600多头，仔猪死亡率30％-40％。
2．2  临床症状调查
    病猪高热，达41 ℃，厌食或不食，呼吸困难，扎堆，有的转圈或抽搐，嘶叫，口吐白沫，卧地不起而死。
2．3  病理学检查
2．3．1  眼观病变
    发病猪或病死猪耳尖、颈部、腹部、臀部和尾部皮肤紫红色。肺脏膨胀，表面凸凹不平，见出血点或出血斑，质地较硬实；间质增宽，两侧肺组织均见病变。心包膜增厚，心脏横径增宽，心肌质地较软；冠状沟脂肪减少并呈黄色胶冻样。肝脏质地较脆，色泽不均一，肝小叶界限清晰。脾脏质地较软，表面不平，呈不同程度肿大，切面隆起且白髓减少。肾脏被膜易于剥离，被膜下有的散在出血点或出血斑，皮髓质界限不清，有的皮质、髓质和肾乳头上均有明显的出血点。淋巴结肿大，表面和切面灰红色或暗红色，切面不平整。扁桃体出血，肿胀，表面有灰白色病灶。胃肠浆膜面、黏膜面出血，黏膜面有的可见溃疡灶。
2．3．2  病理组织学检查
    肺脏：肺泡膈单核细胞和淋巴细胞等为主的炎性细胞浸润和增生，肺泡膈明显增厚，其中部分炎性细胞坏死崩解，肺泡壁被挤压导致肺泡缩小(图1)。有的肺泡壁上皮细胞活化，增生呈立方形；肺泡壁毛细血管扩张，充满红细胞，肺泡腔有红细胞以及纤维素和浆液渗出。细支气管黏膜上皮细胞增生并向管腔形成突起，有的上皮细胞脱落于管腔内，甚至有的支气管上皮细胞呈“套管样”脱落。支气管管壁及其外周均有炎性细胞浸润，并见坏死的细胞产物、渗出的红色丝网状物质。有的肺泡和支气管区域实变，充满炎性细胞，以巨噬细胞和淋巴细胞为主，还有中性粒细胞，以及这些细胞的坏死产物，红细胞和渗出物。有的肺泡联合呈肺气肿表现。
    脑：小血管和毛细血管扩张充满红细胞，血管周围聚集大量淋巴细胞，形成“管套”样结构(图2)，并与周围组织因水肿而有间隙。胶质细胞增生，形成胶质小结。有的小胶质细胞围绕在神经细胞外周或进入其中而出现“卫星”现象和“噬神经元”现象(图3)，部分神经细胞出现固缩，甚至溶解、消失。脉络丛血管扩张充满红细胞，周围炎性细胞浸润，有的发生坏死。
    脾脏：红白髓混乱，脾小结不明显，鞘动脉显见，小梁轻微水肿。动脉周围淋巴鞘内淋巴细胞坏死，可见核破碎、核溶解和核消失，同时可见到较多的核分裂像(图4)，同时可见“满天星”现象。中央动脉内皮细胞肿胀，发生透明变性。白髓炎性细胞浸润，以巨噬细胞为主，还有嗜中性粒细胞和浆细胞。血管淤血，其间散布空泡样物质。
    淋巴结：皮质、髓质淋巴细胞均坏死，表现为核破碎、核溶解和核消失，同时可见“满天星”现象(图5)。淋巴窦内可见大量巨噬细胞和浆细胞及少量的嗜中性粒细胞。小梁水肿，皮质淋巴细胞和网状细胞增生，难以分辩生发中心结构。皮质和髓质均见充血，出血。
    肾脏：皮质，髓质均见血管内充满红细胞。肾小管上皮细胞弥散性坏死，甚至管腔结构也消失(图6)；由于发生透明滴状变，使管腔内有红色圆滴状玻璃物质，以及有一些脱落坏死的上皮细胞、炎性细胞和红色或蓝色丝网状物质；同时发生了脂肪变性、水泡变性和颗粒变性，其中有的圆形空泡内有红色致密样或丝网状物质。肾小球大小不一，充满红细胞，球内细胞坏死；球内有散在的紫褐色颗粒；有的球内结构消失，使肾小球成空泡样。间质炎性细胞浸润，以淋巴细胞和巨噬细胞为主，炎性细胞有的发生坏死。
  
    肝脏：肝小叶结构清晰，间质由于炎性细胞浸润而增宽，以淋巴细胞和巨噬细胞为主，且有的炎性细胞坏死崩解。肝细胞肿胀、有大小不等圆形空泡样物质以及空泡样物质内有丝网状红色物质，为脂肪变性和水泡变性、或坏死，可见胞浆内包涵体。肝血窦扩张充满红细胞，其间可见紫褐色颗粒。
    肠道：肠黏膜上皮细胞几乎全部脱落，固有层炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，还有少量巨噬细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞，炎性细胞有的坏死崩解。固有层、黏膜下层、肌层水肿增厚，其内毛细血管扩张，充满红细胞，血管周围有炎性细胞浸润。
    心脏：可见到血管周围和间质组织淋巴细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润，有的巨噬细胞见吞红现象。部分心肌细胞发生变性，甚至肌纤维坏死断裂，其中有蓝染钙盐颗粒沉着。
    扁桃体：扁桃体淋巴细胞增生，能分辨隐窝，淋巴小结，反应中心等结构，但不清晰。隐窝内充满炎性细胞，以淋巴细胞和巨噬细胞为主，且炎性细胞坏死。上皮细胞气球样变。
2．4  血清学检查
    4份血清送农业部兽医诊断中心。采用ELISA进行PRRSV抗体检测分别为0．870，0．603，1．270和1．001i结果显示4份血清该抗体均强阳性(PRRSV抗体样品检验结果≥0．276判为阳性，<0．276判为阴性)。
2．5  RT-PCR结果
    BJSY—1，BJPG，BJSD和BJBLZ病料RT-PCR扩增产物与预期大小一致。
2．6  病毒增殖
    病料接种Marc—145细胞，第一代不出现病变，盲传2—3代后可出现细胞病变，第5代开始可引起规律性细胞病变(图7)。一般在接毒后36—48 h即可见细胞变圆、聚集成团，48 h以后细胞开始崩解、脱落。
  
2．7  测序RT-PCR结果
    各片段均与预期大小一致(图8)。
  
2．8  基因序列与遗传演化分析
    BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株的各片段连接后基因全长分别为15 319nt、15 317nt、15 344nt和15 316 nt，有8个开放阅读框架，均在5，端有189个核苷酸的非编码区，5’UTR有约7％的碱基发生变异，主要发生在中下游，同时近3，端的40个核苷酸序列高度保守，此外还有2个完全保守的CACCC基了七；ORFI在5，端，占全序列近80％，接着是6个编码框(()RF2—7)，均从5，—3，端部分重叠；3’端分别有147、145、173和144个核苷酸的非编码区。根据遗传进化分析(图9)，BJSY-l、BJPG、BJSD和BJBLZ株同2006年我国报道的JXAl为代表的高致病性PRRSV(1lp—PRRSV)毒株的距离最近，同我国报道的第l株刚-4以及美洲型代表株VR-2332在同一型内，核苷酸同源性在83．3％—99．4％之间，而与欧洲性毒株核苷酸同源性只有58．3％左右，所以说此4株PRRSV均属北美型；与我国分离的高毒力株HB-1为近亲关系，核苷酸水平同源性均在96％以上。
    全基因显示有6个结构蛋白和13个非结构蛋白，研究中意外发现独特的NSP2，2个位置不连续缺失30个氨基酸，与美洲株比较1个保守的天冬氨酸(D)缺失，与欧洲株比较1个保守的丝氨酸(S)缺失，在核苷酸比对时是3个连续的T缺失，中间相隔53个氨基酸后连续缺失29个氨墓酸(图10)。3，UTR后的Poly(A)尾巴在4株中长度不一致，BJSD最长，且末尾有27个连续的A，但是Poly(A)的上游是高度一致的结构蛋白ORF2-7基本片段在核苷酸和氨基酸水平上与美洲株和欧洲株同源性比较结果见表2。
    ORF2编码的氨基酸其间包含222个核苷酸(ORF2b)编码73个氨基酸的蛋白，该蛋白49位和54位同所有的美洲株一样，都是保守的半胱氨酸(Cys)。ORF3的83位氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为甘氨酸(Gly)。ORF5的第二个糖基化位点发生变异，即33-35位的氨基酸相对VR-2332而言由NDS变为NNN，同时也导致抗原相关区发生了变异；66位氨基酸S变为T，92位A变为C，94位V变为A，101—102位FV变为YY，121位T变为I和127位F变为L，使ORF5的3个跨膜功能区均发生了突变；180—197位，即另一个抗原相关区氨基酸发生明显的突变，甚至于所测的4株也不完全一致。ORF6的3个跨膜区位于17-88位氨基酸，其间只有70位K变为R。N蛋白的第23，90位Cys没有发生突变，第46位K变为R；N端以精氨酸(Arg)，赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)为主。
  
3  讨论
    对猪场的流行病学调查表明，本次疾病的发病率高、死亡率高、发病范围广、病程短；临床症状以高热、呼吸道症状、流产等为主，疫情出现猪急性高热性传染病特征；病理学检查表明，主要病变为肢体末梢发紫，多器官出血，间质性肺炎，非化浓性脑炎，变质性肝炎，坏死性脾炎，坏死性淋巴结炎，间质性肾炎，上述病变同文献报道L6-9j的PRRS病变基本一致；应用RT-PCR针对PRRSV特异性片段进行扩增，果为阳性，用Marc-145细胞进行病毒分离培养，出现明显细胞病变，对分离株用RT-PCR方法提取病毒核酸，扩增设计好的包括全长的各个片段，胶回收纯化后测序分析所分离的4株PRRSV均属于北美洲型。
    文献报道，结构蛋白中，ORF6最保守，ORF5和ORF3最易发生变异。有研究表明，ORF3的83位氨基酸与毒力有关，所测的4株该氨基酸均由Glu突变为Gly，该位的突变是否引起了毒力增强值得进一步研究。具有决定感染性的ORF7的第23、90位Cys未发生突变；第46位K变为R；是否改变其核定位信号的功能需进一步研究。特别是NSP2存在30个氨基酸的不连续缺失，这一特点显示为我国2006年高致病性PRRSV毒株所特有的，意味着它可能是异常致病力标志区域，或是此区域的缺失与病毒空间构象相关，从而导致毒株毒力增强。同时提示该区域是PRRSV毒株从分离第1株到今天的高致病性毒株演变的一个标志性区域，因为2002年报道的中国分离强毒HB-2株在此次缺失3个T的区域存在不同的缺失，以及2006年报道的美国分离株MNl84A、B和C株在这次缺失3个T的区域间隔一个核苷酸后有连续的3个核苷酸缺失，在这次缺失29个氨基酸的部位也有不连续的57个核苷酸缺失；且该区域也是美洲株和欧洲株差异显著的区域。另外其他部位的突变或缺失也有可能改变其毒力，导致此次PRRS呈非典型性，正如一些报道此次毒力的变化是多个突变位点累积效应所致。

sxx123

:qinang:

[ts]sxx123 于 2010-5-16 16:51 补充以下内容[/ts]

:qinang:

[ts]sxx123 于 2010-5-16 16:52 补充以下内容[/ts]

:qinang: