甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产ＶＢ１２的影响

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甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产ＶＢ１２的影响
                          来源：中国论文下载中心    [ 08-11-27 13:36:00 ]    编辑：studa0714


                                                  王振国　曹云峰　陈学军　李永亮　李昆太　张嗣良
    [摘要] 通过研究不同甲基供体（甜菜碱和氯化胆碱）对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12的影响，结果表明甜菜碱能显著促进VB12的生物合成；在此基础上考察了发酵培养基中甜菜碱浓度对VB12合成的影响，结果表明15 g/L的甜菜碱下VB12的合成量最高；进一步研究了甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响，结果表明发酵液中一定浓度的甜菜碱可以显著提高δ-氨基乙酰丙酸的合成量，从而促进VB12的合成。
　　[关键词] 甜菜碱；菌体生长；VB12合成；δ-氨基乙酰丙酸；脱氮假单胞杆菌
　　
　　[Abstract] The effect of different methyl-group donors (betaine and choline chloride) on vitamin B12 production in shake flasks with Pseudomonas denitrificans was studied, and the results demonstrated that the addition of betaine to the fermentation medium could greatly stimulate biosynthesis of vitamin B12. Betaine concentration in fermentation medium was further investigated in shake flask, as a result, 15 g/L of betaine was the most beneficial for vitamin B12 synthesis. Moreover, the effect of betaine on the fermentation of P. denitrificans was studied, it was found that the δ-aminolevulinic acid (ALA) biosynthesis could be significantly improved when betaine was kept at certain concentration in the broth, thus the biosynthesis of vitamin B12 was greatly increased.
　　[Key words] Betaine;Cell growth;Vitamin B12 biosynthesis;δ-aminolevulinic acid,;Pseudomonas denitrificans
　　
　　维生素B12（VB12）通常用来表示钴胺素类化合物，它是一种重要的生物活性物质，可以用来治疗恶性贫血症，同时也是许多微生物和动物的生长因子[1]。自然界中，VB12的生物合成存在两种不同的途径，即好氧途径和厌氧途径，但是VB12的生物合成严格局限于一些微生物中[2]，目前用于商业化生产VB12的微生物主要有谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）、菲氏丙酸杆菌（P. freudenreichii）和脱氮假单胞杆菌（Pseudomonas denitrificans）等。P. denitrificans好氧合成VB12的途径已经详细阐明[3]。正是由于对VB12合成途径的了解，所以可以通过诱变和分子生物学等手段来改造菌株，已经使得P. denitrificans菌株的VB12生产能力大大提高[2]。由于VB12产率高, 目前在工业生产中几乎都是使用P. denitrificans来作为好氧生产VB12的工业菌株。P. denitrificans好氧合成VB12的过程一共需要8步甲基化[4]。氯化胆碱（氯化-β-羟乙基-N,N,N-三甲基铵）和甜菜碱（三甲基甘氨酸）的每个分子含有三个甲基，它们通常作为生物合成VB12的甲基供体。White等 [5]第一次报道在P. denitrificans中，甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶对VB12的大量合成具有非常重要的作用。甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基，分别形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[6]，因此甜菜碱在参与VB12生物合成过程中的甲基化具有非常重要的作用。Demain等[7-9]的研究表明，甜菜碱对P. denitrificans中VB12的合成和卟啉的过量生成起着重要的作用。另外，甜菜碱是一种良好的渗透压调节剂[10]，有文献报道甜菜碱和胆碱能促进细胞表面对代谢产物的分泌，从而对细菌产VB12具有刺激效果[11]。
　　甜菜碱在VB12发酵过程中具有非常重要的作用，但是目前很少有文献对甜菜碱所引起的P. denitrificans代谢变化情况进行分析。本文主要考察了甜菜碱对P. denitrificans菌体生长和VB12合成的影响，并通过研究发酵过程pH和δ-氨基乙酰丙酸（ALA）合成量的变化，阐明了甜菜碱所引起的P. denitrificans代谢特征，为工业化发酵生产VB12中的甜菜碱控制工艺提供了重要依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 菌种和培养基
　　菌种：脱氮假单孢杆菌（Pseudomonas denitrificans），石药集团河北华荣制药有限公司。种子培养基（g/L）：蔗糖 40，酵母膏 10， NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1，pH 7.2~7.4。发酵培养基(g/L)：蔗糖 80，酵母膏 30，(NH4)2HPO4 3.0，MgSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 0.1，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI） 0.05，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCO3 1.0，pH7.0～7.2。
　　1.2 仪器与试剂
仪器：8453型紫外-可见分光光度计（Agilent公司）；HP 1100型色谱仪(Agilent公司)。
　　试剂：氰钴胺对照品(含量＞99％，河北华荣制药有限公司)，糖蜜（内蒙古兰田糖业有限公司），甜菜碱(河北华荣制药有限公司)，DMBI(河北科硕化工有限公司)，CoCl2·6H2O(山东临县汇丰钴厂)，ALA (Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。
　　1.3 发酵培养方法
　　种子培养：用无菌水刮洗下斜面菌体，制成菌悬液。取1 ml菌悬液接入装有60 ml种子培养基的300 ml三角瓶中，30 ℃，260 r/min旋转式摇床振荡培养至菌体吸光值(OD700)为10左右。摇瓶培养：300 ml三角瓶中培养基装量为36 ml，接种量10％，32 ℃，于旋转式摇床（260 r/min）培养至96 h。
　　1.4测定方法
　　菌体浓度(DCW)：采用测量菌体干重法(dry cell weight)。吸10 ml发酵液，经离心和洗涤后，菌体烘干至恒重，称菌体干重。VB12测定：采用HPLC法。将被测样品中不同形式的VB12转化为氰钴胺，流动相：V（250 mmol/L磷酸水溶液）∶V（乙腈）= 30∶70；色谱柱：大连依利特Hypersil NH2柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；检测波长：361 nm；进样量：20 μl；流速：1.7 ml/min。甜菜碱测定：比色法[12]，利用甜菜碱与雷氏盐发生反应。δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的测定：按照文献[13]的方法进行测定。
　　2 结果与讨论
　　2.1 两种不同甲基供体对菌体生长和VB12合成的影响
　　甜菜碱和氯化胆碱每个分子都含有三个甲基，常常作为发酵产VB12过程的甲基供体。为了比较二者对P. denitrificans发酵产VB12的影响，在发酵培养基中分别加入10 g/L的甜菜碱、氯化胆碱，结果如图1所示：



　　
　　图1不同甲基供体对P. denitrificans发酵过程的影响
　　Fig. 1The effects of different methyl-group donors on cell growth（solid）(a), broth pH (dash) (a) and VB12 synthesis (b) of P. denitrificans in shake flask
　　
　　由图1a可见，发酵培养基使用甜菜碱的菌体生长量明显要高于使用氯化胆碱，其最大DCW分别为23.04 g/L和18.79 g/L。使用甜菜碱作为甲基供体，发酵过程中的pH较为稳定，一直维持在7.0左右。而使用氯化胆碱作为甲基供体，发酵液的pH急剧下降，第48小时后pH降低至5.0左右，pH的下降很可能是由于氯离子积累而造成的。
　　由图1b可见，使用氯化胆碱的VB12效价明显低于使用甜菜碱的VB12效价，二者放瓶时（96 h）的VB12效价分别为20.75 μg/ml和48.45 μg/ml。
　　2.2 甜菜碱浓度对VB12合成的影响
　　在发酵培养基中加入甜菜碱，浓度分别为0、5、10、15、20、30 g/L。发酵96 h后放瓶，结果见图2。
　　图2 不同浓度的甜菜碱对VB12合成的影响
　　Fig 2. Effect of betaine on the cell growth and vitamin B12 biosynthesis of P. denitrificans
　　
　　从图2可以看出，在P. denitrificans发酵过程中，添加一定量的甜菜碱是十分必要的，它对VB12的合成具有明显的促进作用。发酵培养基不加甜菜碱，虽然得到最大的菌体生物量，但是没有VB12的合成。添加15 g/L甜菜碱的效果最好，VB12的效价达到52.18 μg/ml。
　　2.3 甜菜碱对P. denitrificans发酵过程的影响
　　为了研究甜菜碱对P. denitrificans发酵过程的影响，选择15 g/L和30 g/L的甜菜碱在摇瓶中作进一步实验，以不加甜菜碱作为对照。
2.3.1甜菜碱对pH和菌体生长的影响图3为这三种不同浓度甜菜碱下，发酵过程的pH和菌体生长变化趋势。
　　图3不同浓度甜菜碱下发酵过程的pH和菌体生长变化趋势
　　Fig. 2 Time course of pH (a) and cell growth (b) under various concentrations of betaine in shake flask culture by P. denitrificans.
　　Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine
　　
　　由图3a可见，培养基中不加甜菜碱，pH在第24小时后明显下降，而加入15 g/L和30 g/L的甜菜碱，pH较为稳定。图3b显示的生物量变化表明，培养基中不加甜菜碱，菌体生长最快。此外，15 g/L甜菜碱下的菌体量明显高于30 g/L甜菜碱下的菌体量。
　　2.3.2 甜菜碱对ALA和VB12合成的影响图4为这三种不同浓度甜菜碱对发酵过程ALA和VB12合成的影响结果。
　　由图4a可见，培养基中不加甜菜碱，发酵液中的ALA含量明显低于15 g/L和30 g/L甜菜碱下的ALA含量。在72 h前，15 g/L甜菜碱下的ALA含量还略高于30 g/L甜菜碱下的ALA含量。由图4 b可见，培养基中不加甜菜碱，整个发酵过程的VB12合成量为0。由于15 g/L甜菜碱下的菌体生长较快，其VB12效价明显高于30 g/L甜菜碱下的VB12效价。
　　2.3.3 发酵过程甜菜碱的变化趋势图5为P. denitrificans发酵过程中甜菜碱含量的动态变化。
　　
　　图5 发酵液中甜菜碱浓度的动态变化过程
　　Fig. 5 The dynamic change of betaine concentrations by the fermentation of P. denitrificans in shake flasks.
　　Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine
　　
　　从图5的甜菜碱的动态变化情况可以看出，在第48小时到第72小时期间，甜菜碱利用量最大。培养基加入15 g/L甜菜碱时，在放瓶时（第96小时）发酵中甜菜碱浓度降低到0.19 g/100 ml，这说明15 g/L的甜菜碱刚好满足发酵过程对甜菜碱的需求，不会因为甜菜碱的不足而影响VB12的合成。但是随着培养基中甜菜碱浓度增大，反而会因为甜菜碱过量而影响VB12的合成，而且这对发酵成本的控制也是很不利的。
　　3讨论
　　3.1 关于P. denitrificans好氧合成VB12过程中甲基供体的选择
　　从两种甲基供体对发酵过程的影响可以说明，使用氯化胆碱作为甲基供体，导致发酵液的pH迅速下降，抑制了菌体生长和VB12合成过程中酶的活性，从而导致VB12合成速率下降。因此，选用甜菜碱作为P. denitrificans发酵产VB12的甲基供体是VB12发酵过程中很好的甲基供体。P. denitrificans发酵产VB12的过程中，在发酵培养基中添加一定量的甲基供体能显著促进VB12的生物合成。而使用甜菜碱作为P. denitrificans发酵过程中的甲基供体，对发酵过程的pH控制和VB12的合成效率，都要明显优于使用氯化胆碱。
3.2 关于甜菜碱作为甲基供体对P. denitrificans好氧合成VB12发酵过程的影响和在发酵过程中的使用
　　从甜菜碱对发酵过程的影响可以看出随着甜菜碱浓度的增加，菌体量逐渐下降，这说明甜菜碱对菌体的生长有一定的抑制作用。培养基中不加甜菜碱，可能由于菌体生长代谢旺盛，糖耗加快（数据未列出），从而造成pH下降迅速。而甜菜碱对菌体的生长具有一定抑制作用，所以pH不会因菌体生长过快而明显下降。
　　在P. denitrificans好氧合成VB12的途径中， ALA是生成咕啉环的关键前体物，ALA 合成酶对ALA的合成起着非常重要的调节作用，它也是整个VB12合成途径的关键酶之一[4]。Fa等[14]的研究表明，甜菜碱能显著提高ALA合成酶的活性。由图5的ALA和VB12变化可以推断，由于甜菜碱能促进ALA合成酶活性的提高，从而促进了ALA和VB12的合成。但是发酵液中甜菜碱浓度过高，会对菌体的生长产生一定抑制作用，反而会减少ALA合成量，从而降低VB12的合成。
　　本实验的结果还显示，发酵培养基中甜菜碱浓度的高低不仅影响到ALA和VB12的合成，而且对P. denitrificans的菌体生长也会产生较大的影响。当发酵培养基中添加的甜菜碱浓度过高，会对菌体的生长产生较大的抑制作用，反而更加不利于VB12的合成。
　　鉴于P. denitrificans合成VB12对甜菜碱的需求以及甜菜碱对菌体生长的抑制作用，因此，在P. denitrificans产VB12的发酵过程中，可以采用甜菜碱补加工艺。通过甜菜碱的补加，在满足VB12合成所必需的甜菜碱用量的基础上，又不会因发酵液中甜菜碱浓度过高而影响菌体的生长。
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