求尿酶活性检测方法

火云邪神

谁有尿酶活性的快速测定方法呀？麻烦告诉一下好吗？通过颜色变化时间长短来确定年酶活性是不是达标的那种

李芝银

借机再发一遍。
随着膨化技术在饲料工业中推广普及，越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉，与其它蛋白资源一样，大豆的适度熟化非常重要，熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子，熟化度过高又会导致氨基酸利用率低。判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性。脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下，每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。脲酶本身无营养意义，但它与抗胰蛋白酶的含量接近，并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此，尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标。脲酶活性没有负值，最低为0。在我国现行的国标推荐值为0.3，在美国一般认为以不超过0.2为宜，并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12，当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受。国内很多大企业一般均采用0.2。
实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂，有滴定法和pH增值法两种，已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等。目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性，一般来说，主要有如下两种方法。
一.液态法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂
2.1尿素:GB696，分析纯。
2.2酚红指示剂
2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；
2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。
3.操作方法
3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。
3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。
3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。
颜色出现时间   脲酶活性
1min             极强
1～5min          强
5～15min         稍有
15min             无
同时作空白对照试验。
样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。
一般企业认为7、8分钟变色较为合适。

二、半固态法
1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。
2.试剂
2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。
2.2尿素一酚红试剂
2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；
2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；
2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；
2.2.4用蒸馏水稀释至2L；
2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；
2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；
2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。
3.操作方法
3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。
3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。
3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。
4.放置5分钟后观察：
a.        没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。
b.        有少量红点：少量尿素酶活性，可用。
c.        样品表面约有25％为红点覆盖：少量尿素酶活性，可用。
d.        豆饼表面约有50％为红点覆盖：尿素酶活性较高，不可以使用。
e.        豆饼表面的75％－100％为红点覆盖：尿素酶活性很高，样品过生，不能使用。
以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用，尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍。尽管这两种方法原理一样，但是，因其操作过程差异，所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同。

李芝银

三、液态法和半固态法之比较
首先需要说明的是，这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称，笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法，对前者可以称之为“试管法”，后者称之为“表面皿法”，根据其实施的过程及样品的状态，笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”。
从实施方法来看，液态法是过程检测，从开始一直到规定时间段结束，而半固态法属于断点检测，是5分钟后看结果；液态法通过控制各个体合格，总体自然合格，而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格，即允许部分个体不合格。简单地说，液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色，如果一个不合格，整个批次为不合格；而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色，部分不合格，总体可以是合格的。从这点上来说，液态法对膨化大豆粉的品质要求更高，控制更严格，不仅要求熟化，而且要均匀熟化。举例说明，如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量（可以是一粒）生大豆粉，液态法会立即变色从而判定为不合格，而半固态法只是增加了一个变色点，总体上仍是合格的。
从上可以看出，这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的。半固态法反映的是产品符合统计学上的合格，而液态法反映的是完全合格。这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的，液态法要求设备能均匀熟化，而半固态法允许产品出现部分不合格，只要总体上符合就可以，对膨化设备的要求自然要低。
可能会有人疑问，膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗？其实不然，物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化，机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多，如果结构设计上缺陷或部件磨损，就会导致熟化不均匀。目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右（对家禽和猪要求可能低点），2001年，笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度，用液态法检测仍不合格，出来的料有熟的，有褐变的，还有少许夹生的，如果用半固态法检测，估计就合格了。次年，一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉，因不熟被退货六十吨，根据大部分企业采用半固态法检测的情况，将其以一定比例掺入熟化料中，最终符合统计学上的合格。上述事件，大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧。