大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

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大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

一、基本原理
1、细菌转化（transformation）：将外源DNA导入受体菌株使其由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。
2、感受态细胞：由于外源DNA本身不具备感染细胞的能力，为了使细胞能吸收外源DNA，就必须通过物理或化学处理改变受体细胞的生理状态（细胞膜的通透性），使之具有很高的接受外源DNA的能力，这种经历了处理的具有接受外源DNA能力的细胞叫做感受态细胞。
二、大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性和局限性
1、优越性：
（1）大肠杆菌是迄今为止研究得最详尽的原核生物
（2）已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各种宿主菌和载体
（3）培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行工业化批量生产
（4）实验已经证明，许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达
2、局限性：
（1）不具备真核生物的蛋白质复性系统
（2）缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统
（3）内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定
（4）细胞膜间隙含有大量内毒素，可导致人体热原反应
三、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法
1、CaCl2法
（1）CaCl2法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的化学方法。
（2）优点：易操作，费用低，无需特殊设备。缺点：所制备的感受态细胞转化率低。
（3）原理：将快速生长的大肠杆菌细胞置于经低温（0℃）预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA黏附并在细胞表面形成复合物。此时，42℃热激，外源DNA就可能被细胞吸收。
（4）技术要点：使菌体始终保持低温状态；为防止污染，要在超净台上操作；所有容器都要高温高压灭菌并预冷；操作既要谨慎，又要迅速。
（5）改良Hanahan法：此法是在CaCl2法基础上发展而成，转化率是普通CaCl2法的10～100倍。主要是缓冲液的改良（TB buffer），其中使用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）。
2、电击法：
（1）电击法制备的感受态细胞比CaCl2法稳定、转化率高100～1000倍，但费用较高。需要电转化仪。
（2）原理：利用瞬间高压使细胞膜产生小孔而接受外源DNA。
（3）步骤：将对数生长期的E.coli菌液冷却至4℃离心，用相同温度的纯水洗涤，用10％的甘油悬浮后将高密度菌液置于特制的电极杯中进行电击。
（4）技术要点：低温操作；注意污染；操作中需要将DNA溶液中的盐分全部去掉，否则因盐分而产生高电流，高电流产生火花而杀死E.coli。脱盐一般采用乙醇沉淀DNA的方法。

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