猪病实验室常规诊断技术之十二、猪细小病毒检测方法

nnii521 · 发表于 2009-6-24 21:19:22

十二、猪细小病毒检测方法

猪细小病毒血凝抑制试验操作方法
（一）材料准备
1．抗原：猪细小病毒浓缩抗原
2．PPV阳性及阴性血清
3．被检血清：自被检猪的前腔静脉血或自耳静脉采血分离血清。

4．红细胞：按抗凝剂与血液1：4的比例心脏采集豚鼠血液，用PBS洗三次，沉积红细胞配成0.5%悬液备。

5．稀释液：用灭菌的PH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

6．25%白陶土：取白陶土25克，置离心瓶中，加入适量1mol/L盐酸溶液，充分搅匀，2 000转/分钟离心10分钟，弃上清，再加1mol/L盐酸溶液，搅匀，离心，反复洗三次，沉淀白陶土，用0.15mol/L生理盐水100毫升配成25%悬液，然后用5mol/L氢氧化钠溶液调pH7.2左右,高压灭菌,置4℃备用,保存期不超过半年。

7．器材：96孔U型滴定板或V型滴定板，25微升稀释棒，25微升滴管，微量振荡器，普通离心机。
（一）
试验操作

HA：用滴管在滴定板上从第一孔至试验所需稀释倍数孔，每孔滴加稀释液25微升于第一孔再滴加抗原25微升，用稀释棒从第一孔开始依次稀释。置微量振荡器上振荡15秒，最后每孔滴加0.5%豚鼠红细胞25微升，振荡30分钟，置室1小时判定并记录结果。

HI：用滴管在滴定板上从第一孔至所需稀释倍数孔各加稀释液25微升，于第一孔滴加被检测血清25微升，然后每孔加4单位抗原25微升，振荡15秒，置4℃13小时或室温4小时，每孔加0.5%的豚鼠红细胞悬液25微升，振荡30秒，置室温1小时判定结果。以完全抑制的最高稀释倍数做为HI价。同时设已知阳性血清、已知阴性血清、不加抗原的被检血清及抗原、红细胞对照。抗原对照亦即第二滴定，复核使用单位。
（二）
判定标准及注意事项
1．
判定时先检查对照是否正确，唯有对照各孔准确方可证明操作和使用材料无误。
2．
红细胞凝集现象的判定
（1）红细胞均匀的平均铺于孔底者可判为“++++”。
（2）基本上与（1）相同，但边缘有下滑皱缩者为“+++”。
（3）红细胞于孔底形成环状或成团，四周有小凝集块者为“++”。
（4）红细胞于孔底形成团块，但边缘不整齐或有少量小块者为“+”。
（5）红细胞于孔底形成小团块，边缘整齐光滑，稀释液清亮者为“—”。
“++”以上凝集的最高稀释倍数做为HA价。

3．凝集抑制：本试验红细胞集中于孔底呈团块状，边缘光滑整齐为阳性，以“—”表示，说明抗原凝集红细胞的特性已被抑制，反之红细胞呈“++”以上凝集现象者判为阴性。
1．凝集抑制价：以被检血清最大稀释倍数能抑制红细胞凝集者为该血清抑制价。

(吴
斌)

猪细小病毒病乳胶凝集试验（LAT）操作方法

猪细小病毒乳胶凝集试验是用猪细小病毒培养液致敏乳胶抗原来检测动物血清中的抗体。其具有简便、快速、特异、敏感之优点。
（一）
试验材料
猪细小病毒病乳胶凝集试验抗体检测试剂盒：包括猪细小病毒致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清和稀释液、玻片、吸头及使用说明书。由华中农业大学畜牧兽医学院研制。
（二）
操作方法

1．定性试验：取检测样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴，分置于玻片上，各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1~2分钟，于3~5分钟内观察结果。

2．定量试验：先将血清作连续稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。
（三）结果判定

1．判定标准：

“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；

“+++”大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；

“++”约50％乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；

“+”有少许凝集，液体呈混浊：

“—”液滴呈原有的均匀乳状。

2．对照试验出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“++++”；阴性血清加抗原呈“—” ；抗原加稀释液呈“—”。
以出现“++”以上凝集者判为阳性凝集。
（四）注意事项

1．试剂在2~8℃冷暗处保存，暂定1年。

2．乳胶抗原在使用前应轻轻摇匀。

(吴
斌)

聚合酶链式反应（PCR）检测猪细小病毒

1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。

引物：扩增猪细小病毒VP2基因中445bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列为,
上游引物P1:
5’-CAGAATCAGCAACCTCAC-3’

下游引物P2:
5’-TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG-3’

仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪， PCR扩增仪，电泳仪
2操作步骤：
2.1 样品的采集：采集病猪的淋巴结、肝脏置-20℃保存。
2.2 样品处理 所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。
2.3.
PCR的操作程序
PCR反应体系为：总体积50μl，含有100μmol/L dNTPs，5μmol/L引物， 0.5U Taq酶及1μl模板DNA，常用的反应体系组成如下：

10×缓冲液
5.0 μl

25mM MgCl2
5.0 μl

dNTPs
1.0 μl

引物
各1.0μl

Taq聚合酶
0.5μl

DNA模板
1.0μl

灭菌去离子水
35.50μl

扩増条件为:94℃变性3分钟，进入循环，94℃45秒，54℃45秒，72℃30秒，30个循环后，72℃延伸10分钟。
2.4
PCR产物的检测

PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果，并与标准分子量比较，可见一条445bp的DNA片段。