鸡群抗体检测

lqmin

今天我准备为我的鸡群做一次抗体检测，因为很久没做了，我有一些忘了，所以就在论坛上搜索了一下，没想但居然还没有，我先等我做完了就发篇帖子，完善一下。        

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）

一.准备
1. 抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。（没用完的,可放在冰箱4℃保存,使用前要高压灭菌消毒）
2. .1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。
3. 被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。(注：我用的是蛋黄,较血清低1个滴度。做法：蛋黄和生理盐水1：1稀释，备用)
二.过程
（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价
1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量振荡器上振荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如果到第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。

（二）4单位抗原校正：
1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。
例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。
5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。
（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：
1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
5.室温静置20分钟。
6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
8.室温静置40分钟后观察结果。

四、结果判定：
1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。

2）判定标准：
1.新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
2.H5抗体：抗体值在6以上。
3.H9抗体：抗体值在7以上。
注：低于以上标准，则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。

五、实验后的用具处理：
1、96孔V型反应板的清洗：
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
2、微量滴头的清洗：
新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
3、吸管及积液槽的清洗：
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。



            

lqmin

就怕写不好，让大家笑话！
只能说是尽力了！

xumurenlq

期待中..........

lqmin

我来发贴了！红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）
一.准备
1. 抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。（没用完的,可放在冰箱4℃保存,使用前要高压灭菌消毒）
2. .1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。在离心机中以3000转/分离心5分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/分离心5分钟，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2—3天。使用时用1ml吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。
3. 被检血清：每只鸡心脏或翼下采血0.5-1ml,静置或离心，待血清析出后备用。(注：我用的是蛋黄,较血清低1个滴度。做法：蛋黄和生理盐水1：1稀释，备用)
二.过程
（一）血凝（HA）试验：采用96孔V型反应板，测定抗原效价
1、首先用微量移液器向反应板的每孔加生理盐水25微升。
2、用微量移液器吸取待测抗原25微升于第一孔中并挤压6次混合，后吸出25微升至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25微升。
3、微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25微升。
4、置于微量振荡器上振荡1分钟。
5、室温静置30分钟后观察结果。
6、结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。如果到第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256。

（二）4单位抗原校正：
1、根据抗原效价结果配制相应比例的抗原稀释液：即4单位抗原。
例：上图1：抗原效价为1：256，HI试验时，25微升抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原作256/4=64倍稀释。即取0.1毫升抗原，加入6.4毫升生理盐水。
2、首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升。第一孔不加。
3、用微量移液器吸取4单位抗原25微升分别加入第一孔、第二孔中，从第二孔开始挤压6次混合，后吸出25微升至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25微升。
4、用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1-6孔，每孔25微升。
5、于微量振荡器上振荡1分钟。
6、室温静置30分钟后观察结果。
7、结果观察：第一、二、三孔为完全凝集，第四孔红细胞为50%沉淀，第五孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位抗原准确，校正成立。
（三）血凝抑制（HI）试验：每排孔检查1份血清。步骤如下：
1.用微量移液器先加25微升生理盐水于各孔中。
2.用微量移液器吸取待检血清25微升置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25微升。最后一孔不稀释，为红细胞对照。
3.用微量移液器吸取配制好的抗原，每孔25微升。
4.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
5.室温静置20分钟。
6.用微量移液器吸取1%红细胞悬液于每孔各加25微升。
7.置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀。
8.室温静置40分钟后观察结果。

四、结果判定：
1）判定结果：以完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度，以2的指数表示。

2）判定标准：
1.新城疫抗体：育雏育成鸡在7以上，产蛋鸡在9以上。
2.H5抗体：抗体值在6以上。
3.H9抗体：抗体值在7以上。
注：低于以上标准，则需要进行免疫。
3)免疫后抗体规律
一般活疫苗免后7-10天产生抗体，2-3周抗体到达峰值，可以维持2个月。灭活疫苗免后10-15天产生抗体，3-4周抗体到达峰值，可以维持3-4个月。

五、实验后的用具处理：
1、96孔V型反应板的清洗：
新反应板可直接放入清洁液中浸泡24小时，用过的反应板先用流水冲净孔中的反应物，然后泡在清洁液中，24小时后捞出，甩掉清洁液，放入流水中冲洗干净后，在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，摆放在恒温箱中，烤干备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
2、微量滴头的清洗：
新滴头直接放入清洗液中浸泡，用过的用清水冲洗掉滴头中的血清后浸泡在清洁液中，最少浸泡24小时，捞出后用流动水冲洗掉滴头内外的清洁液，然后在蒸馏水中冲洗一遍，甩干，放入恒温箱中烤干，备用。属塑料制品，70℃以下烤干。
3、吸管及积液槽的清洗：
将吸管及积液槽直接浸泡在清洁液中，24小时后捞出，用流动水冲洗干净后在蒸馏水中再冲洗一遍，甩干，吸管放入高温干燥箱中160℃干燥1—2小时后备用，玻璃制品可高温烤干。积液槽放入恒温箱中烘干。

李业明

写的很好啊！谢谢分享！！

波浪

谢谢楼主分享，正需要这方面的资料。不错，学习了。

stongqingqing

先前还迷糊呢，不知道怎么判定，现在一看全明白了

noah

写的不错，但实际中抗体的没有这么高啊

chengdunykjxy

做抗体要的实验室环境还是要讲究一下，这样做出来的水平才更加的准确。

noah

4单位抗原的制备很重要，你说的好像不太对吧