转 广西野猪猪瘟病毒感染情况的调查报告

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广西野猪猪瘟病毒感染情况的调查报告

陈凤莲,马玲,潘汉世,黄红梅,孙建华,陈忠伟,吴健敏

(广西兽医研究所,南宁　530001)

摘要:作者报道采用RT-PCR和ELISA方法检测猪瘟病毒在野猪身上的感染情况。采集广西5个地市28份野猪脾淋组
织作病毒检测,设计针对猪瘟(classical swine fever, CSF)病毒的特异性引物CSFVE2,进行RT-PCR检测,所检样品结果全呈
猪瘟阴性;同时,运用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测以上样品,结果也都呈阴性。这一结果初步表明所检测的广西5
个地区的野猪没有感染猪瘟病毒。
关键词:猪瘟病毒;野猪;RT-PCR;ELISA
中图分类号:S852.65+1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1671-7236(2007)08-0075-03

野猪( sus scrofa)属于偶蹄目,猪科,主要分布在欧亚大陆的南部,即分布于欧洲、北非和亚洲中
部天山山脉的欧洲野猪,分布于中国大陆、台湾、爪哇、苏门答腊和新几内亚的亚洲野猪。近年来,由于野猪独特的营养价值而备受亲睐,野猪资源也逐渐受到保护,如广东已将野猪列为省重点保护动物。但是,除了对野猪生态学和利用方面研究较多外,对其疾病及其在森林生态环境中疾病控制方面的研究报道甚少。
猪瘟(classical swine fever ,CSF)是严重危害
全球养猪业的重要传染病,是我国主要的畜禽疫病之一。近年来本病以多种形式发生,非典型猪瘟(雷梦珍,1995)、繁殖障碍、新生仔猪先天性感染(王雯慧等,2000)等,给本病的诊断与防控带来很大的困难。野猪是猪瘟病毒的自然贮存宿主,野猪中存在
CSFV的持续感染,目前为止仍然是欧盟国家爆发猪瘟的最重要传染源(涂长春,2003),因而也是欧盟各国控制消灭CSFV首要考虑的因素之一。我国野猪资源丰富,目前为止尚未见到开展野猪感染猪瘟的调查报道,因此我国野猪中是否也存在CSFV感染,是猪瘟防控工作中急待了解的问题。因此,开展野猪中CSFV感染的情况调查,对我们了解CS-FV的生态环境,制定CSFV的控制与净化措施,开发野猪资源等都具有十分重要的意义。本试验用RT-PCR技术和ELISA方法检测来自广西境内5个山区市县的28份野猪组织材料,以了解广西境内野猪CSFV的感染情况,现将结果报道如下:
1　材料和方法
1.1　野猪检测材料　2006年采自广西崇左、河池、柳州、百色、梧州5个市(县)野外捕杀野猪的脾脏与淋巴结,共28份(其中有3份为1998年采集,来自百色田林县)。1.2　主要试剂　M-MLV反转录酶、TaqDNA聚合酶购自Promega公司;Trizol购自Invitrogen公司; dNTPs、DL2000 DNA Marker、RNasin等购自TaKaRa公司。猪瘟抗原检测试剂盒(ELISA检测试剂盒)为美国IDEXX公司产品。
1.3　引物合成　根据已发表的CSFV Alfort株的E2基因序列(Meyers等,1996),设计了1对简并引
物:CSFV-F:5’-TC(GA)(AT)CAACCAA(TC) GAGATAGGG-3’;CSFV-R:5’-CACAG(CT)CC (AG)AA(TC)CC(AG)AAGTCATC-3’,预期扩增目的片段长度约为216 bp。由北京博迈德生物技
术有限责任公司合成。
1.4　材料中总RNA的抽提　取大约1 g上述野猪脾、淋组织,于研磨器充分研磨,用Hanks液1∶5稀释,反复冻融3次,8000 r/min离心10 min,取上清液400μl,加入800μl Trizol,混匀后室温放置
5 min。加入200μl氯仿,旋涡振荡15 s混匀,室温下放置2~3 min,12000 r/min离心10 min。取上
清转移到新的EP管,再加入500μl异丙醇混匀,室温下放置10 min。12000 r/min离心10 min,弃上
清,再加入75%酒精1000μl,旋涡振荡混匀,12000r/min离心5 min,晾干,用适量无Rnase水溶解
RNA,-20℃冻存备用。
1.5　病毒cDNA合成　取16μl上述RNA与1μlCSFV-R引物混匀,于PCR仪中70℃5 min,90℃
5 min后,立即冰浴5 min。在上液中加入如下试剂:5×RT buffer 5μl,dNTP ( 2.5 mmol/L) 4μl, RNasin 0.5μl, M-MLV反转录酶0.5μl,混匀后置PCR仪中42℃反转录1 h后于-20℃保存备用。
1.6　CSFVE2基因片段的扩增　PCR反应体系为25μl ,各成分如下:10×PCR buffer 2.5μl,dNTP
(2.5 mmol/L) 2.5μl,CSFV-F和CSFV-R(2.5pmol/L)各0.5μl,cDNA模板2.0μl,0.25μTaqDNA聚合酶(5 U/ul),加H2O至25μl。PCR反应程序为:94℃预变性3 min;94℃1 min,56℃1 min,72℃1 min,35个循环; 72℃延伸5 min。反应结束后取5μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳,在凝胶成像系统上观察目的片段。1.7　ELISA方法检测猪瘟抗原　除了选用其中20份野猪脾、淋组织外,还选取了3份由本室保存的猪瘟阳性病料一同进行检测。具体操作按试剂盒说明书进行。首先在每孔中加入25μl CSFV特异性单克隆抗体;然后再加入75μl制备的样品,混匀;置湿盒,室温孵育过夜;用洗涤液洗涤5次后,在每孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记物,湿盒中孵育1 h;再用洗涤液洗涤5次,于每孔加入100μl底物液,在暗处室温孵育10 min后,每孔加入100μl终止液终止反应,最后在酶标仪上测量样品在450 nm处的OD值。本试验设立2孔阴、阳性对照。结果判定:被检样品校正OD值≥0.300,判为阳性;校正OD值<0.200判为阴性;校正OD值在0.200~0.300之间判为可疑。OD值校正方法见说明书。
2　结果
2.1　RT-PCR对野猪脾、淋组织的检测结果　采用RT-PCR技术,利用CSFV特异性引物,对5个地区28份野猪材料及2份猪瘟阳性病料进行扩增。结果阳性对照在约216 bp处扩增出CSFVE2基因目的片段,而所有被检野猪组织均没有扩增出CSFV目的片段,初步表明所检测的野猪被检样品没有检测到CSFV(图1为部分被检样品结果)。2.2　ELISA方法对野猪组织样品的检测结果　为
了进一步验证上述RT-PCR的检测结果,再采用美国IDEXX公司猪瘟ELISA抗原检测试剂盒,对野
猪样品进行检测,结果除了3份猪瘟阳性病料检测的OD值大于0.3以外,其余20份野猪材料检测的OD值均小于0.2(表1),CSFV检测阴性。由此进一步说明这些野猪没有受到CSFV感染。
3　讨论与小结
国外有报道(Kaden等,1999)认为在猪瘟病毒的检测方法中,RT-PCR和病毒分离是目前敏感性
较高的试验方法,ELISA诊断方法次之。由于病毒分离的试验周期较长,且成功率不高,所以目前多采用RT-PCR。本试验在运用RT-PCR检测的基础上,再用IDEXX公司猪瘟Ag-ELISA检测试剂盒,
对来自广西5个山区市(县)的28份野猪材料进行检测,结果全部为阴性,2种检测方法结果一致,初
步说明广西这些区域的野猪(野生)没有受到CSFV的感染。猪瘟是危害养猪业最严重的传染病之一,是世界各国重点防制的动物疫病。每年都投入巨大的防制经费,制定并采取严密的防控措施。我国是猪瘟的老疫区,猪瘟的问题长期困扰着我国的养猪业,如何控制净化猪瘟病毒是摆在我们面前一个长期而艰巨的任务。涂长春课题组经过大量艰苦细致的工作,发现我国猪瘟病毒的流行毒株分为2个基因群,
4个基因亚群,其中基因2群属优势基因群,它们与欧洲流行的2群病毒甚至和流行于欧洲野猪群中的毒株在遗传上有亲缘关系。但到目前为止,我国野猪中是否存在猪瘟病毒感染仍未见报道。尽管本试验因条件限制,采样地区狭小,样品数量有限,但也能反映一定的问题。因此,我们的调查结果
不但丰富了我国猪瘟病毒流行病学、生态环境的资料,而且对制定猪瘟控制与净化措施具有重要
的指导作用。
参考文献
1　Depner K R, Muller A, Gruber A,et al. Classical swine fever inwild boar (Sus scrofa) experimental infections and viral persist-ence[J]. Dtsch Tierarztl Wochenschr,1995, 102(10):381~384.
2　Kaden V ,Lange E, Polster U, et al. Study on the virulence oftwo field isolate of the classical Swine Fever virus genotype 2.3rostock in wild boars of different age groups[J]. J Vet Med B In-
fect Dis Vet Public Health,2004,51(5):202~208.
3　Kaden V, Steyer H, Strebelow G, et al. Detection of low-viru-lent classical swine fever virus in blood of experimentally infectedanimals: comparison of different methods[J]. Acta Virol, 1999, 43(6):373~380.
4　Leforban Y,Cariolet R. Characterization and pathogenicity forpig a hog cholera virus strain isolated from wild boars[J]. AnnRech Vet,1992,23(1):93~100.
5　Meyers G, et al. Molecular cloning and nucleotide sequecneof the genome of hog cholera virus[J]. Virol, 1996,171:555~567.

一人立刀

这是07年的吗？有没有近期的文章呢

tian11aiguo

野猪没有感染猪瘟野毒，很有意思的一件事情，猪瘟野毒的基因群？？？

gonghao848

原来野猪也会感染病毒的阿