不同配方稀释粉对公猪鲜精保存的效果分析

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不同配方稀释粉对公猪鲜精保存的效果分析

孙德林 吕小燕

（北京浩邦猪人工授精服务有限责任公司 101300 ）

摘 要:精液稀释液成本占人工受精整体成本费用很大的比例，因此研究出经济高效的稀释液对降低人工受精成本有重要意义。本文通过成对比较实验，用 5 种不同配方稀释粉按照国内 AI 标准技术对种公猪的合格鲜精进行稀释保存，观察不同配方稀释粉对公猪鲜精保存时间长短、精子活力、精子畸形率的影响。结果表明：配方 hotboar ++ 对公猪精液的保存效果最为显著，而且其通用性及成本也显著低于现有商品化稀释粉。关键词：猪 人工受精 稀释液 保存时间 活力 畸形率 通用性

前 言

    随着我国养猪业的不断发展和种猪联合育种工作的需要，猪人工受精的迅速普及，同时不同规模的猪人工受精站已成为我国养猪行业的一重要组成部分。人工受精站为了能够充分利用优秀种公猪，发挥其种猪优势，达到真正意义上的资源共享，因此精液保存时间、精液保存效果是人工受精的应用成败的关键因素，开发出保存时间长、保存效果良好、成本显著低于现有商品化的精液稀释液的稀释液，对人工受精技术而言有重要的经济效益。
1. 实验材料与方法     通过第一轮稀释粉配方的收集、调整，我们从 20 种配方实验中筛选出四种配方，分别是 BTS 、配方 hotboar ++ （ BTS 改进配方）、配方 4 号、配方 5 号，我们重新对此四种稀释粉配方与法国卡苏 BTS +2 稀释粉做对照跟踪实验，其原理是利用浩邦优秀种公猪新鲜精液采用国内 AI 标准技术进行精液的稀释保存 , 通过实验对不同配方稀释液保存效果进行一一比较，选择最佳稀释粉效果配方。
1.1 实验动物    种公猪精液来自北京浩邦猪人工受精服务中心公猪站的 20 头公猪，其中， 6 个长白， 11 个大白， 3 个杜洛克。公猪按常规饲养方法进行饲养管理，生长发育正常。本实验除 1 头丹系长白（耳号 179101 ）重复一次外，其它公猪均采鲜精一次。
1.2 试剂及主要仪器1.2.1 试剂
    实验的五种配方均按配方准备所有化学药品和生化制剂。严格控制实验配方中实验药品
* 项目资助：北京市科委“首都 248 工程项目”，首席专家：中国农业大学王楚端教授     质量、生产日期、厂家、药品级别，稀释粉的配制通过精密天平称量每一种化学试剂需求量，配好后的稀释粉充分溶解稳定、过滤、消毒后进行 PH 值、渗透压等的测定，并进一步加热，使用前加入抗生素（庆大霉素 350mg ）以备用。严格按照公猪新鲜精液稀释保存的 GTC 实验要求进行精液的稀释保存。
1.2.2 主要仪器
     常规仪器、桑翌科技公司提供的 PH6 测定仪、法国卡苏公司提供的精密精子密度测定仪
1.3 、实验设计
     按正常采精方法，采集 1 个公猪精液，通过 GTC 实验室检测精液不论从颜色、气味、精子活力、精子畸形率等均达到鲜精合格标准，立即抽取 6 个样，抽取办法是根据每头份精液中含有 30 亿有效精子， 80 毫升 / 头份，计算抽取合格原精液剂量，严格控制不同实验稀释液温度，使其稀释液的温度和精液的温度完全吻合，然后缓慢将不同的稀释液加入到所抽样品中，加至 80 毫升，整个稀释过程要在 15 分钟内完成，精液稀释完成后并标记，密封，待 1-2 小时精液温度缓慢降止 20-23 ℃ 时，用毛巾裹上一同放入恒温箱内，每 12 小时轻轻摇匀精液并检测精子活力、精子畸形率等指标，直至精子活力下降到 0.6 以下时停止检测，记录保存时间，精子活力、精子畸形率。以上步骤重复 20 次。
1.4 测定记录指标
     精液的颜色、气味：通过观察及人的嗅觉来主观判断
    精子活力：按照精液中做直线前进运动的精子占总精子的百分率。检测精子活力，检测精液时精液必须预热到 37 ℃， 在 100 倍显微镜下观察，鲜精活力要求不低于 70 ，保存后精子活力不得低于 60
    精子畸形率：精子畸形评定是通过肉眼 600 倍镜下观察 200 个精子中畸形精子所占比例
    PH 值测定：通过桑翌科技公司提供的 PH6 测定仪测定
    精子密度：精子密度是通过法国卡苏公司提供的精密精子密度测定仪测定
1.5 实验稀释液配方（略）及成本费用

表 1 4 种配方稀释粉及对照稀释粉

实验配方   BTS   hotboar++ 4 5 卡苏 BTS+2
成本 2.88 元 3.81 元 4.16 元 4.48 元 20.00 元
2. 统计分析      利用 MICROSOFT EXCELR 软件的 TTEST 对不同稀释液处理的精液的保存时间、保存时间临界点精子活力、精子畸形率进行成对比较 , 本文对不同稀释液的精液保存时间、保存过程中精子活力、精子畸形率进行分析 .
2.1 实验结果与分析
2.1.1 不同稀释液的精液保存时间
由表 2 我们可以得到所有实验稀释液对精液的总体平均保存时间 4.00 天。

表 2 不同公猪精液应用不同稀释液的精液保存时间 （ 天 ）

公猪号	稀释液
	BTS	BTS4	5 号	4 号	卡苏 BTS +2
1	3.0	5.0	2.0	3.5	4.0
2	3.5	6.5	3.0	4.5	6.5
3	3.5	6.0	3.0	4.5	6.5
4	2.0	2.5	1.5	2.5	2.0
5	4.5	5.0	3.0	4.0	5.5
6	4.0	6.5	3.5	4.5	6.5
7	2.5	4.5	2.5	3.5	4.5
8	4.5	6.5	4.0	5.0	6.5
9	3.5	5.5	3.5	4.5	6.0
10	3.0	4.0	3.0	3.5	3.0
11	3.5	5.0	4.5	5.0	4.5
12	2.0	3.0	2.5	2.0	3.5
13	3.0	4.5	3.0	5.0	4.0
14	5.5	6.5	5.0	4.5	6.0
15	5.5	6.0	4.5	5.0	5.5
16	4.0	5.0	3.5	4.0	4.5
17	4.5	6.5	5.0	4.5	6.5
18	2.0	2.5	2.0	3.0	2.5
19	2.5	3.0	1.5	2.0	2.5
20	2.5	4.0	3.5	5.0	5.0
平均	3.45	4.9	3.2	4.0	4.775

    不同配方稀释液对鲜精保存时间及比较结果见表 3 ，本实验中，应用 BTS 、 hotboar++ 、 4 号、 5 号、卡苏稀释粉 BTS+2 稀释液配方的精液平均保存时间分别为： 3.45 ± 1.075 天， 4.9 ± 1.382 天、 4.0 ± 1.044 天， 3.2 ± 0.987 天， 4.775 ± 1.509 天，其中 BTS4 保存时间最长平均为 4.9 天，其次卡苏 BTS+2 。

表 3 不同稀释液对鲜精保存时间及比较结果

项目	稀释液
	BTS	hotboar++	5 号	4 号	卡苏 BTS+2
样本数（ N ）	20	20	20	20	20
均平保存时间（小时）	3.45	4.90	4.0	3.2	4.775
标准误	1.075	1.382	1.044	0.987	1.0509
T 检验概率值 ***	0.000 *	0.000	0.040	0.047
	0.517 **	0.210	0.000
	0.156 ***	0.746
	0.001

     注： *表示 BTS配方稀释液与 hotboar++配方稀释液对种公猪精液平均保存时间的 T检验概率值； **表示 BTS配方稀释液与 5号配方稀释液对种公猪精液平均保存时间的 T检验概率值；其它依次类推； T检验概率值 >0.05时，两者差异不显著； <0.05时，两者差异显著； <0.01时，两者差异极显著。    成对 T 检验结果表明， hotboar++ 配方组稀释液 与法国卡苏 BTS +2 配方组稀释液对种公猪精液的保存时间差异不显著，但 hotboar++ 配方组稀释液 与法国卡苏 BTS +2 配方组稀释液对精液的保存时间极显著高于 BTS 配方组稀释液 ， 5 号配方组稀释液； hotboar++ 配方组稀释液 与 4号配方组 稀释液 相比较差异不显著，法国卡苏 BTS +2 配方组稀释液显著高于 4 号配方组稀释液。 4 号配方组稀释液与 BTS 配方组稀释液差异不显著，但显著高于 5 号配方组稀释液； BTS 配方组稀释液与 5 号配方组稀释液之间差异不显著。
2.1.2 不同稀释液的精液保存时间的相关性    表 4 列出不同稀释液保存精液的相关性。不同稀释液对精液保存时间的 相关性可反映稀释液与精液之间的互作效应。相关性高，表示稀释液与精液之间的互作效应小，该稀释液的通用性就强；相反，该稀释液的通用性就差，意味着不同鲜精的最佳稀释液不同，因此，有待于研究出多种能够适应不同品种甚至不同个体的精液保存稀释液，这样，变大大增加了人工受精生产管理的复杂程度。
    本实验中，由表 4 BTS配方组稀释液的精液保存时间与 hotboar+2配方组稀释液 、 5 号 配方组稀释液 、 4 号 配方组稀释液 及卡苏 BTS+2 配方组 稀释液的皮尔逊相关系数分别为 -1.450 、 0.25 、 -0.55 、 -1.325 ； hotboar+2 配方组 稀释液与 5 号 配方组 稀释液、 4 号 配方组 稀释液及卡苏 BTS+2配方组 稀释液的皮尔逊相关系数分别为 1.700 、 0.99 、 1.25 ； 5 号 配方组 稀释液与 4 号 配方组 稀释液及卡苏 BTS+2 配方组 稀释液的皮尔逊相关系数分别为 -0.800 、 -1.75 ； 4 号 配方组 稀释液及卡苏 BTS+2 配方组 稀释液稀释液的皮尔逊相关系数为 -0.775
    如果用一种稀释液与其它 5 种 配方 稀释液相关系数的平均值来表示本实验中 5 种配方稀释液的通用性，其相关系数平均值越高说明配方稀释液的通用性越高， BTS 配方组 稀释液、 hotboar+2 配方组 稀释液、 5 号 配方组 稀释液、 4 号 配方组 稀释液及卡苏 BTS+2 配方组 稀释液的相对通用性分别为 -0.615 、 0.835 、 -1.1875 、 -0.065 、 0.710
表 4 列出不同稀释液保存精液的相关性

项目	稀释液
	BTS	hotboar++	5 号	4 号	卡苏 BTS+2
配方间相关系数 **	-1.450 *	1.700	-0.800	-0.775
	0.25 **	0.99	-1.575
	-0.55-	1.25
	1.325
通用性	-0.615 ***	0.835	-1.1875	-0.065	0.710

    注： * 表示 BTS
配方组 稀释液与 hotboar++ 配方组 稀释液 对精液保存时间的皮尔逊相关系数； ** 表示 BTS
配方组 稀释液与 5 号配方 组 稀释液 对精液保存时间的皮尔逊相关系数；依次类推。 *** 表示 BTS
配方组 稀释液与其它 5 种 配方组 稀释液 对精液保存时间的皮尔逊相关系数平均值；依次类推。
     由列表 4 我们可以得到 hotboar++配方组 稀释液通用性最好。2.2 不同稀释液对保存精液中精子畸形率比较结果    不同稀释液对保存精液中精子活力的影响结果比较见表 5 ，本实验中，应用 BTS 配方组 稀释液 、 hotboar++ 配方组 稀释液 、 4 号 配方组 稀释液 、 5 号 配方组 稀释液 、卡苏稀释粉 BTS+2 配方组 稀释液在保存精液期间精液中精子活力的平均水平分别为： 68 ± 4.70 、 72 ± 5.50 、 67.75 ± 3.80 、 69.75 ± 4.22 、 72.25 ± 5.73 ，其中卡苏稀释粉 BTS +2 维护精子活力能力较强、其次 hotboar++ 配方组 稀释液。
    成对 T 检验结果表明， hotboar++ 配方组 稀释液 与卡苏 BTS+2 配方组 稀释液对保存精液中精子活力的影响相比较差异不显著，但 hotboar++ 配方组 稀释液 与卡苏 BTS+2 配方 组 稀释液对保存精液中精子活力的影响显著高于 BTS 配方 组 稀释液 、 5 号配方 组 稀释液，但与 4 号配方 组 稀释液相比较差异不显著；稀释粉 BTS 配方组 稀释液 、 5号配方组 稀释液 及 4号配方组 稀释液对保存精液中精子活力的影响 相比较差异不显著.

表 5 不同稀释液对保存精液中精子活力影响比较结果

项目	稀释液
	BTS	hotboar++	5 号	4 号	卡苏 BTS+2
样本数（ N ）	20	20	20	20	20
保存 3 天精子活力均值	68	72	67.75	69.75	72.25
标准误	4.70	5.50	3.80	4.22	5.73
T 检验概率值 ***	* 0.005	0.003	0.203	0.113
	** 0.873	0.081	0.005
	0.265	0.873
	0.008

    注： * 表示 BTS 配方组稀释液与 hotboar ++配方组稀释液 对保存精液中精子活力影响的 T 检验概率值； **表示 BTS 配方组稀释液与 5 号配方组稀释液 对保存精液中精子活力影响的 T 检验概率值 ；依次类推。 T 检验概率值 >0.05时，两者差异不显著； <0.05时，两者差异显著； <0.01时，两者差异极显著。
2.3 不同稀释液对保存精液中精子畸形率的影响结果比较    不同稀释液对保存精液中精子畸形率的影响结果比较见表 6 ，本实验中，应用 BTS配方组稀释液 、 hotboar ++配方组稀释液 、 4 号配方组稀释液、 5 号配方组稀释液及卡苏 BTS+2配方组稀释液 对保存精液中精子畸形率的平均水平分别为： 10.75 ± 5.68 、 7.25 ± 6.58 、 11.00 ± 5.98 、 10.25 ± 5.50 、 8.75 ± 5.82 ，其中 hotboar++配方组稀释液 对保存精液中精子畸形影响最小、其次卡苏 BTS+2配方组稀释液 。
    成对 T 检验结果表明， BTS配方组稀释液 、 hotboar++配方组稀释液 、 4 号配方组稀释液、 5 号配方组稀释液 与卡苏 BTS +2 配方组稀释液对保存精液中精子畸形率的影响相比较差异不显著 。

表 6 不同稀释液对保存精液中精子畸形率影响比较结果

项目	稀释液
	BTS	hotboar++	5 号	4 号	卡苏 BTS+2
样本数（ N ）	20	20	20	20	20
保存 3 天精子畸形率均值	10.75	7.25	11.00	10.25	8.75
标准误	5.68	6.58	5.98	5.50	5.82
T 检验概率值 ***	* 3.50	-3.75	.75	-1.50
	** -.25	-3.00	2.25
	.50	-1.50
	2.00

注： * 表示 BTS 配方组稀释液与 hotboar++配方组稀释液 对保存精液中精子畸形率影响 T 检验概率值； **表示 BTS 配方组稀释液与 5 号配方组稀释液 对保存精液中精子畸形率影响的 T 检验概率值 ，依次类推。 T 检验概率值 >0.05时，两者差异不显著； <0.05时，两者差异显著； <0.01时，两者差异极显著。
3. 讨论与结论     人工受精成本中稀释粉成本占整个成本的很大比例，因此，研究开发出经济高效的稀释液对降低人工受精成本具有重要的意义。本研究对当前国际上应用较多的稀释液、及相对改进的稀释液配方进行成对的比较，其中卡苏 BTS+2 的稀释液是使用卡苏 BTS+2 稀释粉配置而成的，其它四种稀释液是按照原来配方及改进的配方自行购买原料，严格按照配方每种试剂级别要求，精确称取每种试剂配置成稀释粉，然后根据需要配置成相应的稀释液，其成本显著比卡苏 BTS+2 稀释粉的低。研究结果表明， hotboar++ 配方稀释粉对精液的平均保存时间最长，平均保存时间为（ 4.90 ± 1.382 ），与现市场上购买的中长效卡苏 BTS+2 的稀释粉在保存时间上差异不显著，但显著好与其他实验的配方稀释粉， hotboar++ 配方稀释粉通用性最高，其次卡苏 BTS+2 的稀释粉；本次实验中五种配方稀释粉中 hotboar++ 配方稀释粉与卡苏 BTS+2 的稀释粉对精液中精子活力的影响差异不显著，但显著好与其他三种配方；在精液保存的整个过程中五种配方稀释粉对精液中精子畸形率的影响差异不显著。
    由以上实验结果我们将 hotboar+2 配方稀释粉列为中长效稀释粉，再进一步改进生产工艺，生产成品 hotboar++ 配方稀释粉，这样将会给整个人工受精成本大大减荷。
项目来源 : 北京市 248 项目

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