鱼类生活的环境和鱼类消化道中存在着大量的微生物，在鱼类生长发育过程中，鱼类消化道逐渐形成了一个由好氧菌、兼性厌氧菌和绝对厌氧菌组成的动态正常菌群。正常情况下，鱼类消化道的各种微生物生长良好，占主导优势的有益微生物菌群能使消化道处于健康环境中，从而保证鱼类消化道的正常消化和吸收。同时，有益微生物菌群定植于肠内壁黏膜，形成非特异性的生物保护屏障，抑制病原菌对肠壁的定植，维持肠道正常的微生态平衡。但当出现饵料或环境变更等应激状态时，这种理想的微生物区系平衡会受到冲击，宿主的正常防御系统被破坏，某些条件致病菌会转移、定植并侵袭鱼体的其它组织器官，导致细菌性疾病的暴发[1]。因此，如何利用益生素、化学益生素等调控鱼类消化道微生物的组成，保持鱼类消化道微生物区系平衡，维持动物健康正成为国际上的研究热点。
1鱼类消化道微生物的组成和分布
鱼卵孵化前表面附着有大量的细菌，但刚孵化鱼的胃肠道通常是无菌的。孵化后的仔鱼在卵黄囊消耗以前就会开始饮水，水中的细菌得以进入仔鱼的消化道。稍大一点的仔鱼还会摄食附着有大量细菌的悬浮颗粒和卵黄碎片。因此，养殖水体、悬浮颗粒和卵黄碎片的细菌成为仔鱼消化道微生物区系的最初来源。但是，鱼类胃肠道环境不同于水体环境，仅那些能适应鱼类胃肠道环境和宿主的免疫系统的微生物能够定植于胃肠道。研究表明，仔鱼期形成了最初的不稳定的微生物区系，随后此微生物区系逐渐成熟，幼鱼期形成比较稳定的微生物区系。例如，罗非鱼（Tilapia mossambica）在孵化后20~60 d内建立起比较成熟的微生物区系[2]。仔稚鱼免疫系统尚未发育完成，它们更多的是依赖非特异性防御机制，其中，胃肠道粘膜上附着的正常菌群可能是仔稚鱼对抗致病菌入侵的第一道屏障。然而，由于传统方法的严重制约，特别是消化道微生物区系复杂多样且需厌氧环境，目前有关仔稚鱼消化道微生物的研究较少，仔稚鱼胃肠道粘膜上附着的菌群种类、功能和变化尚不清楚。令人欣喜的是，随着分子生物学技术的日益发展，DGGE、TGGE等DNA指纹技术有望用于鱼类消化道微生物区系的研究，从而加深人们对鱼类消化道微生物菌群分布和功能的了解[3]。
有关幼鱼和成鱼消化道微生物区系组成研究较多，报道结果也不尽相同。但通常情况下，淡水鱼消化道中常见的微生物主要有气单胞菌(Aeromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、邻单胞菌(Plesiomonas)、肠杆菌(Enterobacter)等，而海水鱼消化道中最常见的是弧菌(Vibrio)、假单胞菌、不动杆菌(Acinetobacter) 等[3]。成鱼的消化系统已经发育完成，消化道微生物区系变得相对稳定。但是，当出现病原菌侵袭、饵料或环境变更等应激状态时，这种理想的微生物区系平衡会受到冲击，宿主的正常防御系统被破坏。Lodemel等[4]报道，正常情况下北极嘉鱼(Salvelinus alpinus L.)肠道微绒毛上附着有大量的细菌，而人工感染杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida ssp. Salmonicida)后，附着于肠道的细菌数量下降了100倍，提示感染致病菌后北极嘉鱼肠道正常菌群数量急剧下降。随后，Ringo等[5]研究了杀鲑气单胞菌攻毒对北极嘉鱼肠道微生物的影响。结果表明，攻毒后北极嘉鱼肠道微生物区系发生了一些变化，而肉杆菌(Carnobacterium) 则持续存在于后肠，且能阻止致病菌在肠道的定植，作者由此推断肉杆菌是北极嘉鱼肠道的固有菌群，是北极嘉鱼对抗致病菌定植的天然菌群屏障的重要组成部分。此外，Olsen等[6]研究了急性应激（养殖水面下降到5－10cm，用长杆追逐鱼15min）和饥饿应激对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)消化道微生物区系的影响。电镜结果表明，附着于后肠的微生物种类和数量均显著下降，而粪中的微生物数量则上升，提示急性应激可能会导致肠道粘膜的大量脱落。但是，也有研究表明，急性应激和饥饿应激11天对大西洋鲑(Salmo salar L.)肠道细菌总数和栖鱼肉杆菌（Carnobacterium piscicola）没有影响[7]。
随着人们对鱼类消化道微生物结构和功能认识的深入，一些学者还对鱼类各段消化道微生物的分布进行了研究，但报道的结果不一。多数研究表明，从前到后鱼类各段消化道附着的微生物数量呈逐渐上升趋势，这个结果相继在大西洋鲑(Salmo salar)、鲱（Seriola quinqueradiata）、都花舌鳎（Solea solea）和北极嘉鱼(Salvelinus alpinus
L.)消化道微生物的研究中得到证实[1，8]。与之相反，Austin等[9]报道，虹鳟各段消化道细菌数量呈逐渐下降的趋势。而Ringo等[10]的研究发现北极嘉鱼附着于小肠和大肠的细菌数量非常恒定。但是，目前有关有益菌（如某些乳酸菌）和致病菌（如某些弧菌）在鱼类各段消化道分布的报道很少。这也制约了乳酸菌等有益菌作为益生素在鱼类养殖过程中的应用，因为如果所用益生菌在鱼类消化道的定植位点与致病菌的定植位点不一致，则难以发挥其益生效果[3]。因此，鱼类消化道重有益菌和致病菌的分布尚须今后深入研究。
2 鱼类消化道微生物的调控
鱼类消化道正常菌群的建立对于消化系统的正常发育具有重要的作用，而且正常菌群的建立能够作为生物屏障阻止致病菌的入侵，同时提高鱼类的免疫力。因此，加强鱼消化道微生物菌群分布和功能的研究，在此基础上开发出绿色高效的益生素和化学益生素等调控鱼消化道微生物菌群，保持消化道微生物区的稳定，有望提高鱼类的抗病力和生产性能。
2.1益生素
益生素（Probiotics）“是一类通过促进肠道微生物平衡对宿主动物产生有益影响的活的微生物饲料添加剂”[11]，最早应用于陆生动物。此后的研究表明益生素在水产养殖中亦具有一定的应用效果。但是，水生生物由于与水环境密切相关，许多情况下有益微生物，如光合细菌可直接添加于养殖水体，通过拮抗病原菌、降解多余有机质等对养殖动物产生有益的影响。因此Gram等 [12]将益生素的含义扩展为“一类通过改善微生物平衡来促进寄主健康的活的微生物饲料添加剂”。研究表明，芽孢杆菌（Bacillus）、乳酸菌（lactic acid bacteria）、假单胞菌(Pseudomonas)和弧菌(Vibrio)均可作为水产动物益生素调控消化道微生物的组成，而目前研究得最多的是芽孢杆菌和乳酸菌[3]。
芽孢杆菌(Bacillus)是一类革兰氏阳性菌，在肠道或贮藏过程中都以内生孢子的形式存在，因此其抗逆性很强。芽孢杆菌进入肠道后，在肠道上部迅速复活，消耗大量的氧，有利于肠道固有菌群繁殖，同时有效抑制病原菌生长，维持肠道微生态平衡，促进动物的健康生长。目前，在水产养殖也中应用较多的芽孢菌主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和蜡样芽孢杆菌（Bacilis Cereus）等。Kozasa[13]用1株从土壤中分离的东洋芽孢杆菌(Bacillus toyoi)处理日本鳗鲡(Anguilla japonica)，降低了由爱德华氏菌(Edwardsiella)引起的鳗鲡死亡。华雪铭等报道，基础日粮中添加0.1％的由三种芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热球状芽孢杆菌混合而成的益生菌，可以明显提高暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）幼鱼的生长速度[ 14 ]。华雪铭等[15]在异育银鲫 (Carassiusauratus gibelio)饲料中添加不同浓度的芽孢杆菌，结果表明芽孢杆菌可以极显著地提高异育银鲫对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的抵抗能力，添加量为0.2%的实验组异育银鲫的相对增重率比对照组增加33%。总之，芽孢杆菌能提高鱼类的存活率，促进动物生长，但是有关芽孢杆菌对鱼类肠道菌群调控的研究较少。刘波等研究表明，基础日粮中添加0.02%的地衣芽孢杆菌后，异育银鲫增重率显著提高，其肠道食糜中芽孢杆菌和乳酸杆菌的数量大大增加，大肠杆菌的数量则显著降低[16]。胡东兴报道，从鲤鱼(Cyprinus Carpio)体内分离的地衣芽孢杆菌对气单孢菌有生物拮抗作用[17]。因此，有关芽孢杆菌对鱼类肠道菌群调控尚须今后深入研究。
(Gadus morhua)仔鱼肠道的优势菌，仔鱼的抗病力有一定的提高。王福强等[19]报道，投喂含有1.2×109cfu/g乳杆菌的饲料5 d后，牙鲆(Paralichthys olivaceus)消化道定植的乳酸菌超过106cfu/g，同时弧菌数量明显下降，提示乳杆菌能有效抑制弧菌的生长。Campos等[20]报道，多株乳酸菌均通过产生细菌素抑制病原菌的生长。同时，乳酸菌在代谢过程中产生乳酸、乙酸等有机酸，可降低消化道pH值。因为多数致病菌难以在低pH值环境中生长良好，因此乳酸菌造成的这种低pH值环境能抑制病原菌的生长和繁殖。此外，大量研究显示，乳酸菌是良好的免疫激活剂，添加于饵料中能有效刺激机体的免疫系统，增强鱼类的抗病力[3]。
假单胞菌(Pseudomona)为革兰氏阴性直或略弯曲的杆菌，不产生芽孢。作为鱼类消化道的正常菌群，某些假单胞菌具有作为益生菌的潜力[21，22]。早期研究表明，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)能产生抑菌物质抑制鱼类病原菌的生长[23，24]。Gram等[12]研究表明，荧光假单胞菌AH2能体外抑制鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的生长，体内试验亦得到一致结果，即荧光假单胞菌能降低人工感染鳗弧菌虹鳟的死亡率：感染鳗弧菌7 d后试验组虹鳟的死亡率仅为25％，而对照组的死亡率高达47％。Spanggaard等[25]从虹鳟体表、腮和肠道分离到45株能抑制致病性鳗弧菌生长的细菌，其中28株属于假单胞菌。作者选择了其中9株（7株假单胞菌和2株肉杆菌）进行动物试验，结果表明6株假单胞菌能提高人工感染鳗弧菌虹鳟的存活率。然而gram等[26]研究表明，假单胞菌虽然能体外抑制杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)，但对于人工感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑则没有保护作用。因此，假单胞菌对鱼类的保护作用及对消化道微生物的调控还有待深入研究。
弧菌通常菌体较小，弯曲成弧状或逗号状，广泛存在于海水及淡水中，亦可见于动物和人的消化道。虽然许多弧菌对于鱼类具有一定的致病作用，但少数研究表明某些弧菌也具有一定的益生作用。Austin等[27]报道，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)能有效降低杀鲑气单胞菌和两株致病性弧菌对大西洋鲑(Salmo salar)的致病作用，以该菌作为益生菌时，大西洋鲑的存活率显著提高。Iranto等[28]报道，分离自虹鳟消化道的河流弧菌（Vibrio fluvialis）作为饲料添加剂时，人工感染杀鲑气单胞菌虹鳟的存活率明显提高。同一试验中，饲喂河流弧菌虹鳟的血清和粘膜的杀鲑气单胞菌抗体没有明显提高，而红细胞、吞噬细胞、淋巴细胞、白细胞数量增加，溶菌酶活性增强。但是，迄今尚未见弧菌对鱼类消化道微生物调控的报道。
2.2化学益生素
化学益生素一词译于“Prebiotics”，也称前生素、益生元等，是一类非消化性食物成分，到达后肠后可选择性地刺激动物肠道有益菌的增殖，抑制潜在有害菌的增殖的作用[29]。化学益生素必须具备以下三个条件：第一，在消化道前段不会被降解和吸收；第二，作为一种或几种肠道细菌特异性的底物，选择性地促进相应细菌的增殖；第三，能够改善肠道菌群结构，促进宿主健康。目前研究和应用较多的化学益生素主要为寡糖和非淀粉多糖。陆生动物研究结果表明，许多寡糖进入小肠后，不能被病原菌如大肠杆菌和沙门氏菌利用，只能被有益菌如乳酸杆菌和双歧杆菌等分解利用，从而促进有益菌大量繁殖。同时，有益菌大量繁殖使肠道pH 值下降，这样一方面直接抑制病原菌的生长，另一方面使肠道氧化还原电势降低，具有调节肠道正常蠕动的作用，间接阻止病原菌在肠道中的定植[30]。Mahious等[31]研究了菊糖和果寡糖作为化学益生素对大菱鲆（Scophthatmus maximus）生产性能及消化道微生物的影响。结果表明，果寡糖能显著提高大菱鲆的生长速度。此外，饲喂果寡糖的大菱鲆肠道中分离到大量芽孢杆菌，而其它饲料组则没有分离到芽孢杆菌，提示果寡糖能选择性的促进芽孢杆菌等有益菌的增殖。国内张红梅等[32]研究了甘露寡聚糖对生长期鲤鱼的生长及肠道菌群的影响。结果表明，饵料中添加甘露寡聚糖45 d后，鲤鱼肠道大肠杆菌的数量显著降低，而乳酸杆菌和双歧杆菌(Bifidobacterium)数量略有上升，且以添加0.3％的甘露寡聚糖试验组结果最为明显。作者由此得出结论：饵料中添加0.3％甘露寡聚糖可使鲤鱼养殖达到最好的生产性能，也最有利于肠道菌群的优化。
大量研究表明，非淀粉多糖能提高鱼类的免疫功能[33，34]，但有关非淀粉多糖对鱼类消化道细菌菌群的调控研究很少。Ringo等[35]利用梯度稀释平板技术和电镜技术相结合研究了糊精和菊糖对大西洋鲑鱼后肠微生物的影响。结果表明，饲喂糊精的鲑鱼肠道微生物主要为葡萄球菌（Staphylococcus）、假单胞菌、微球菌（Micrococcus）等，而饲喂菊糖的鲑鱼后肠道细菌数量较低，但肉杆菌、葡萄球菌、链球菌（Streptococcus）等革兰氏阳性菌成为优势菌群，提示菊糖对大西洋鲑肠道菌群具有较好的调控作用。国内蔡雪峰等[36]发现壳聚糖对虹鳟幼鱼肠道菌群也有相似的影响，即饲喂壳聚糖后虹鳟幼鱼肠道革兰氏阳性菌的数量上升，而假单胞菌等革兰氏阴性菌数量下降。最近，迟淑艳等[37]研究表明，奥尼罗非鱼（Oreochromis aureus
♂×Oreochromis niloticus♀）饲料种添加1.0％～1.5％ β-葡聚糖，可以明显改善其生长性能和抗嗜水气单胞菌感染的能力。
总之，化学益生素作为饲料添加剂能调节鱼类消化道微生物组成，提高鱼类的抗病力和生产性能，但化学益生素对鱼类消化道细菌菌群的调控机制尚有待进一步研究。
2.3 中草药
中草药来源于天然植物，成分众多，除含有具有直接医疗价值的有效成分外，还含有蛋白质、多糖、脂类、微量元素、维生素等营养成分，这使中草药尤其复方中药具有多种药理效应。大量研究表明，中药能够明显改变肠道细菌组成及数量，使有益菌类增加，并抑制条件致病菌的生长，从而有效地调节病鱼胃肠道的微生态平衡。罗琳等[38]报道，穿心莲对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肠道细菌的种类，尤其是优势菌群的种类没有明显影响，但１％和２％的穿心莲可降低草鱼肠道内气单胞菌的数量。刘红柏等[39]将5 种常用中草药黄芩、板兰根、黄芪、茯苓及鱼腥草作为饲料添加剂饲喂鲤鱼，均使鲤鱼肠内细菌数增加，并对组成产生影响，试验组出现了对照组所没有的芽孢杆菌属及棒杆菌属（Corynebacterium）细菌，并且使优势菌群的组成发生了改变，不动细菌属明显增加，芽孢杆菌属所占的比率也在10%以上，而气单胞菌属、邻单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属及肠杆菌科细菌数量则明显下降。但是，由于中草药成分非常复杂，其对鱼类消化道微生物的调控机理尚不清楚，有待今后进一步研究。
3 展望
虽然“鱼类消化道微生物分布及其调控”的研究正成为当前国际上的一个前沿研究领域。但是长期以来，由于传统方法的严重制约，特别是消化道微生物区系复杂多样且需厌氧环境，有关鱼类消化道微生物区系及其调控的研究还很薄弱。这也间接导致了生产中益生素和化学益生素的使用效果不稳定，限制了其在水产养殖中的应用。因此，加强鱼类消化道微生物组成和结构的研究，指导高效绿色的益生素、化学益生素和中草药的开发和使用，促进我国水产养殖的同时，还将有助于从根本上解决我国水产养殖过程中抗生素和其它化学药物的长期大量使用所带来的负面效应，具有重要而深远的意义。 | 
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发表于 2008-8-8 15:12:19
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