β-葡聚糖酶活力测定

和兴

1．原理
在一定温度和PH条件下β-葡聚糖酶水解β-葡聚糖。产生的还原糖可将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙色的氨基化合物，反应液颜色强度与酶解产生的还原糖的量成正比，而还原糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。通过测定反应液的吸光度，从而计算出待测液β-葡聚糖酶活力。
2．试剂和溶液：
2．110.0mg/ml的葡萄糖溶液
称取无水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100ml。
2．20.05mol/L柠檬酸盐酸性缓冲液
a、0.5mol/L的柠檬酸溶液：
准确称取105.0g柠檬酸完全溶于800ml的蒸馏水中，定容至1000ml。标记为A试液.
b、0.5mol/L的柠檬酸三钠溶液：
准确称取147.0g柠檬酸三钠完全溶于800ml的蒸馏水中，定容至1000ml。标记为B试液.
c、0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液：
取600ml的A试液与1000ml的B试液充分混匀。标记为C试液.
d、0.05mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液（pH 4.80）：
取C试液1000ml加入到8000ml的蒸馏水中。用PH计检测其PH值，必要时用3mol/L的盐酸溶液或3mol/L氢氧化钠溶液调PH值为4.80。再定容至10000ml。混匀后标记为0.05mol/L酸性缓冲液,同时标记pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱内保存。
2．31.0%β-葡聚糖底物：
精密称取β-葡聚糖1.0000g溶于100mL 0.05mol/L的酸性缓冲液中，磁力搅拌至完全溶解（室温下3小时以上）。用3mol/L盐酸溶液或3mol/L氢氧化钠溶液调pH值为4.80，再用0.05mol/L的酸性缓冲液定容在100 mL的容量瓶中。标记为1.0%β-葡聚糖酸性溶液，同时标记pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱内。使用前恢复到室温，并摇匀。
2．4DNS试剂
溶解10.0g3,5—二硝基水扬酸，16.0g氢氧化钠和300.00g酒石酸钾钠于约700 mL蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并用蒸馏水定容至1000 mL,置棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用。
3．仪器和设备：
3．1 分析天平：感量0.0001g
3．2 精密pH计：精确至0.01
3．3 磁力加热搅拌器
3．4分光光度计：应符合GB9721有关规定，5mm比色皿
3．5电热恒温水浴锅：30—100℃，±0.1℃
3．6 计时器：每小时误差不超过五秒
3．7 移液器：100—1000μl
3．8 微量进样器：0-50μl
4．分析步骤：
4．1 标准曲线的绘制：
取8支试管按下表加入试剂，稀释葡萄糖标准液；再加入3 mL DNS试剂。充分混匀置沸水中煮5min。水浴冷却后，用0号试管作对照在540nm下测其他试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。

试管号	0	1	2	3	4	5	6	7
缓冲液加入量 （μL ）	1000	990	980	975	970	965	960	955
葡萄糖标准液加入量 （μL）	0	10	20	25	30	35	40	45
葡萄糖含量 （μg）	0	100	200	250	300	350	400	450

4．2 待测酶液的制备：
4．2．1液体酶：用缓冲液稀释原酶液，使其吸光度（OD值）在0.20— 0.25之间。
4．2．2 固体酶：精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80ml蒸馏水中（稀释倍数≤100倍的直接用缓冲液溶解）；室温下磁力搅拌15min以上；用100ml容量瓶定容。离心后取清液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.20— 0.25之间。
4．3 水平控制：
用已知酶活力的标准样作水平检查。
4．4 活力的测定：
4．4．1 取三支试管各加入0.5ml底物，与待测酶液一起在50℃（±1℃）水浴中预热5min。
4．4．2 在第一、二试管中各加入0.5ml待测酶液，40℃水浴中反应10min。
4．4．3 在三支试管中各加入3ml的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5ml的待测酶液
4．4．4 摇匀三支试管后，在沸水浴中煮5min。
4．4．5 水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一、二试管样的吸光值。吸光值以在0.20— 0.25之间为宜，若不在此范围可改变稀释倍数重做。
5．酶活力的计算：
酶活力（IU/mL或IU/g）= (葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n
式中：180指葡萄糖从微克换算成微克分子数
10指待测液与底物的反应时间
0.5指与底物反应的待测酶液量
n指原酶液（或固体原酶）的稀释倍数
6．允许分析结果可以接受标准：
6．1 允许总分析误差范围，两次取样并且检测结果相对误差小于10%。
6．2 水平控制检测酶活力与标准活力相对误差小于10%。
6．3 标准曲线至少由5点组成