饲料添加剂中木聚糖酶活力的测定分光光度法

和兴

饲料添加剂中木聚糖酶活力的测定分光光度法
1.1木聚糖酶活力单位
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为10mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
1.2.原理
木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。
1.3.试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
1.3.1氢氧化钠溶液，浓度c(NaOH)为200g/L
称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.2乙酸溶液，浓度c（CH3COOH）为0.1mol/L
吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。
1.3.3乙酸钠溶液，浓度c（CH3COONa）为0.1mol/L
称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.4乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：
称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。在加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（1.3.2）或乙酸钠溶液（1.3.3）调节至5.5。
1.3.5木糖溶液，浓度c（C5H10O5）为10.0mg/ml:
称取无水木糖1.000g，加乙酸—乙酸钠缓冲液（1.3.4）溶解，定容至100ml。
1.3.6木聚糖溶液：1.0%
称取（Sigma X0627）1.00g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（1.3.4）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（1.3.4）定容至100ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀，4℃避光保存，有效期为3天。
1.3.7 DNS试剂
称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（1.3.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。
1.4仪器与设备
1.4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。
1.4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
1.4.3 分析天平：感量0.001g。
1.4.4 pH计：精确至0.01。
1.4.5 磁力搅拌器：附加热功能。
1.4.6 电磁振荡器
1.4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45um。
1.4.8 离心机：3000 r/min
1.4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。
1.4.10 秒表：每小时误差不超过5s。
1.4.11 分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。
1.4.12 移液器：精度为1 ul。
1.4.13 冰箱。
1.5.标准曲线的绘制
吸取缓冲液（1.3.4）4.0ml，加入DNS试剂（1.3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。?
分别吸取木糖溶液（1.3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、和7.00ml，分别用缓冲液（1.3.4）定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/ml葡萄糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml缓冲液（1.3.4）和5ml DNS试剂（1.3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。
以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
1.6试样溶液的制备
固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm），按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001g。加入40ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲液（5.4）定容至100ml，在4℃条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，上离心机3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲液（5.4）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好控制在0.04-0.08U/ml之间）。
液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好控制在0.04-0.08 U/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节校正至5.5，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。
1.7测定步骤
吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液（5.6），37℃平衡10min。
吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试过中，再加入5ml DNS 试剂（1.3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液（1.3.6），37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样（参见1.5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml羧甲基纤维素钠（1.3.6）（已经过37℃平衡），电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0ml DNS 试剂（1.3.7），电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样（参见1.5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。
8试样酶活力的计算
XD=[( AE- AB)×K+ CO] ×1000×总体积/ M / T /样品总量------（1）
X=XD·Df------------------------------------------（2）
式中：XD — 试样稀释液的纤维素酶活力，U/ml；
AE — 酶反应液的吸光度；
AB — 酶空白样的吸光度；
K — 标准曲线斜率；
CO — 标准曲线的截距；
M—木糖的摩尔质量M（C5H5O5）=150.2g/mol；
T — 酶解反应时间，min；
1000 — 转化因子，1mmol =1000umol；
XD值应在0.04—0.08U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X — 试样纤维素酶的活力，U/g；
Df — 试样的总稀释倍数。
酶活力的计算值保留三位有效数字。
9重复性
同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均 值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。
　　　　　　饲料添加剂中纤维素酶活力的测定分光光度法
1.1纤维素酶活力单位
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
1.2.原理
纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。
1.3.试剂与溶液
除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。
1.3.1氢氧化钠溶液，浓度c(NaOH)为200g/L:
称取氢氧化钠20.0g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.2乙酸溶液，浓度c（CH3COOH）为0.1mol/L:
吸取冰乙酸0.60ml。加水溶解，定容至100ml。
1.3.3乙酸钠溶液，浓度c（CH3COONa）为0.1mol/L:
称取三水乙酸钠1.36g。加水溶解，定容至100ml。
1.3.4乙酸—乙酸钠缓冲溶液，c（CH3COOH—CH3COONa）为0.1mol/L，pH值为5.5：
称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70ml。在加水溶解，定容至2000ml。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.5，再用乙酸溶液（1.3.2）或乙酸钠溶液（1.3.3）调节至5.5。
1.3.5葡萄糖溶液，浓度c（C6H12O6）为10.0mg/ml:
称取无水葡萄糖1.000g，加乙酸—乙酸钠缓冲液（1.3.4）溶解，定容至100ml。
1.3.6羧甲基纤维素钠（Sigma C5678）0.80g，加入80ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（1.3.4）。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解（注：在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml。）。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（1.3.4）定容至100ml。羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。
1.3.7 DNS试剂
称取3，5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500ml，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液（1.3.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。
1.4仪器与设备
1.4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵。
1.4.2 分样筛：孔径为0.25mm（60目）。
1.4.3 分析天平：感量0.001g。
1.4.4 pH计：精确至0.01。
1.4.5 磁力搅拌器：附加热功能。
1.4.6 电磁振荡器
1.4.7 烧结玻璃过滤器：孔径为0.45um。
1.4.8 离心机：3000 r/min
1.4.9 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。
1.4.10 秒表：每小时误差不超过5s。
1.4.11 分光光度计：能检测350—800nm的吸光度范围。
1.4.12 移液器：精度为1 ul。
1.4.13 冰箱。
1.5.标准曲线的绘制
吸取缓冲液（1.3.4）4.0ml，加入DNS试剂（1.3.7）5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。?
分别吸取葡萄糖溶液（1.3.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、和7.00ml，分别用缓冲液（1.3.4）定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/ml葡萄糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml（做两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml缓冲液（1.3.4）和5ml DNS试剂（1.3.7）。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。
以葡萄糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
1.6试样溶液的制备
固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm），按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.001g。加入40ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）。磁力搅拌30min，再用缓冲液（5.4）定容至100ml，在4℃条件下避光保存24h。摇匀，取出30-50ml，上离心机3min。吸取5.00ml上清液，再用缓冲液（5.4）做二次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好控制在0.04-0.08U/ml之间）。
液体样品可以直接用乙酸—乙酸钠缓冲溶液（5.4）进行稀释、定容（稀释后的酶液中纤维素酶活力最好控制在0.04-0.08 U/ml之间）。如果稀释后酶液的pH值偏离5.5，需要用乙酸溶液（5.2）或乙酸钠溶液（5.3）调节校正至5.5，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。
1.7测定步骤
吸取10.0ml羧甲基纤维素钠溶液（5.6），37℃平衡10min。
吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试过中，再加入5ml DNS 试剂（1.3.7），电磁振荡3s。然后加入2.0ml羧甲基纤维素钠溶液（1.3.6），37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样（参见1.5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml羧甲基纤维素钠（1.3.6）（已经过37℃平衡），电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0ml DNS 试剂（1.3.7），电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样（参见1.5）为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
8试样酶活力的计算
XD=[( AE- AB)×K+ CO] ×1000×总体积/ M / T /样品总量---------（1）
X=XD·Df----------------------------------------------------（2）
式中：
XD — 试样稀释液的纤维素酶活力，U/ml；
AE — 酶反应液的吸光度；
AB — 酶空白样的吸光度；
K — 标准曲线斜率；
CO — 标准曲线的截距；
M — 葡萄糖的摩尔质量M（C6H12O6）=180.2g/mol；
t — 酶解反应时间，min；
1000 — 转化因子，1mmol =1000umol；
XD值应在0.04—0.08U/ml之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
X — 试样纤维素酶的活力，U/g；
Df — 试样的总稀释倍数。
酶活力的计算值保留三位有效数字。
9重复性
同一试样两个平行测定值的相对误差不超过8.0%，二者的平均 值为最终的酶活力测定值（保留三位有效数字）。

tgz5637

按这个农业部方法，测出的结果低。逼迫企业要改宣传资料和批文

[ 本帖最后由 tgz5637 于 2008-7-7 09:25 编辑 ]

feilong4120

现实中企业好像都有自己的企标，完全对不上楼主这个方法！现在市场这么混乱，到底那个方法好好像说不清楚，再说，发酵生产用的菌种不一样，酶的特性也会有所差异。用一种单一的测量模式很难判断。

fangke3546

我们马上也要开展这个项目，希望大家能讨论下

tgz5637

夏盛的木聚糖酶酶活，报出来都吓小朋友。1000万单位/g 和 6000万单位/g , 如果用农标法标准检测，你们估计是多少？我估计1000万单位/g大约在9万单位/g左右，6000万单位/g大约在50万 ,看你的XD有效取值范围落在那个附近（靠0.04就大些，靠近0.12就更小，总之这个农标方法误差很大，不靠谱）。

lichoushui

楼主：
1.7.1中应该是木聚糖底物2ml。
这种配DNS试剂和QB 2583——2003有一些差别，这对酶活有影响吗？