猪传染病的准确诊断——寻找从临床到实验室的衔接

dragonli97

猪传染病的准确诊断——寻找从临床到实验室的衔接

李龙* 浙江大学动物预防医学研究所, 杭州，310029

章叶恩 上海诺华动物保健有限公司，上海，200031

* 现工作地址：Department of molecular microbiology and immunology, University of Missouri-Columbia, MO, 65203, USA

E-mail: dragonli97@hotmail.com或lilo@missouri.edu










多病原的混合感染已经成为当前猪传染性疾病流行的最主要特征之一，导致发病率和死亡率的显著上升，带来巨大的经济损失，同时造成了病猪临床症状的不典型，为诊断带来了很大的难度，临床上，我门已经很难简单地将几个症状组合起来就判定是什么疾病。例如与PRDC相关的病原包括PRRSV、肺炎支原体（Mh）、PCV-2、CSFV、链球菌、副猪嗜血杆菌、猪放线杆菌、巴氏杆菌等等，上述两种以上的病原混合感染时，造成的损失大大加剧。因此在具有丰富临床经验的兽医指导下，寻找有效的疾病控制措施的同时，很多时候我们需要对疾病进行实验室确诊。如何衔接从临床到实验室的过程，就显得十分重要。经验丰富的兽医在诊断疾病的同时，能够按照几个大类对可能感染的病原进行分类，然后针对性的采集、保存和送检病料。然而临床上，往往由于病料的选择、采集方法、储存和运输方式不正确，大致最后送到实验室的样本无法进行检测，或导致检测结果不准确，最后延误了疾病的诊断，甚至造成误诊。本文就上述工作展开几个原则性的讨论，为临床病料的收集和运输，提供一些有实际意义的建议。

一、临床诊断
这个环节需要经验丰富的兽医来做出对疾病的初步诊断，对临床症状十分典型的病例果断地采取措施。然而，多病原的混合感染已经十分普遍，仅凭临床表现有时很难对疾病进行准确诊断。因此更为有意义的临床诊断是在上述基础上，对可能感染的几种病原体进行一个指向，特别是分类细菌性、病毒性和寄生虫性的感染，在及时采取措施的前提下，来提示进一步的实验室诊断；另外，临床经验并不丰富的实验室人员一般很难直接从送检的病料特征上判断可能的疾病，特别是为了运输方便，只是采集了部分脏器的病料。因此临床兽医与实验室人员的良好沟通、针对性地采集病料和送检，对实验室的诊断有很大的帮助。
二、 实验室诊断
1、寄生虫的诊断
对寄生虫的实验室诊断相对容易，通常情况下，直接制备涂片、触片、或者网筛富集后制备涂片、有时辅助以染色，通过显微镜观察虫体就可以作出诊断。当然，临床诊断的指向作用的意义十分重要，一个最简单的例子，区分可能是血液还是肠道感染了寄生虫，是开始制备检查材料的前提。当然也不排除其他的一些复杂情况。分子生物学方法（如PCR）也在很多寄生虫疾病的诊断中发挥了很好的作用，如弓形虫的诊断。
2、细菌分离鉴定
在进行细菌分离鉴定时，临床诊断的指向作用就显得意义重大了。因为不同的细菌对培养环境、营养需求是有很大差别的。比如只是为了鉴别诊断大肠杆菌和沙门氏菌，那么普通的麦康凯培养基就可以了；但是如果是怀疑是链球菌则需要血平板来培养；如果怀疑是副猪嗜血杆菌或猪放线杆菌，最好采用巧克力平板来分离，针对某些血清型，甚至需要加入NAD。总之不同的细菌的培养条件差异很大。考虑到实验条件和成本、在针对同一份病料进行细菌分离鉴定时，一般不会同时使用很多种培养基。因此，如果临床诊断的指向性不强或出现偏差，往往会导致实验室细菌分离的失败，无法继续诊断程序。
3、血清学和病毒检测
目前对多种病毒性病原的血清学诊断方法已经相对成熟，包括PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2等等，其中以PRV的鉴别诊断最为理想。但是通常情况下，由于缺乏对流行病学和疫苗免疫背景的清晰调查，血清学诊断结果的指导作用往往会打折扣。因此强指向性的临床诊断结果会大大有助于实验室结果的分析和确诊。同样的开展病原学的诊断可以极大程度地提高实验室诊断的准确性。如针对CSFV的抗原捕获ELISA和PCR、针对PRV gE或gD基因设计的鉴别诊断PCR、针对PRRSV的荧光定量PCR等等。同样的进行病原学诊断的前提是获得流行病学和疫苗免疫的背景资料，例如，刚刚免疫了CSFV，就采集扁桃体进行PCR检测CSFV，显然是不合适的。

三、 病料的采集
在整个疾病的诊断过程中，病料采集可以说是最简单的一个步骤，但又是衔接临床与实验室的关键步骤，如果没有一个指向性的临床诊断和基微生物学知识基础，很多时候会犯一些小错误。
1、寄生虫和细菌性疾病的病料采集和运送
一个强烈的建议：针对寄生虫和细菌分离鉴定的病料，只要条件允许最好直接送检活猪。当然如果条件不允许，也要送检完整的脏器系统，如整个的肝脏、整个的心脏、整个的脾脏，上述条件对保证样品在送检过程中不被污染是至关重要。送检的动物或者用于采集病料的动物，最好在送检前1周，停止使用所有抗寄生虫药物和抗生素，这样能够让关键的致病寄生虫或者细菌得以大量繁殖，有利于下一步的病原分离。同样的，选取的送检动物最好是那些将死未死的发病动物，原因同上。
一个必须满足的条件：上述用途的病料一定要新鲜！！！所谓新鲜，一个简单的解释就是不能冷冻和腐败。如果将病料冷冻处理，由于细胞内形成冰晶，细胞膜被刺破，在下次解冻时，寄生虫和细菌就死亡了，进一步的分离也就中断了。如果是腐败的病料，那么病料中含有的最多的细菌就不是疾病相关的了，而是腐败相关的细菌，这显然会大大影响分离的结果。那么如何在运送过程中保证病料的新鲜呢？这对于活体运送，没有问题。但是运送脏器病料就需要采取一些必要的措施，一个简单的方法是，将病料按不同脏器或者不同动物的所有脏器，以保鲜袋分开包装编号后，置于泡沫保温箱中，然后放入足够的冰块（矿泉水瓶灌水冷冻即可），保证整个运送过程中病料处于新鲜状态。
在完成了上述步骤后，就是实验室的工作的了。在这里只是简单地描述一下。寄生虫的分离和观察，比较简单，但是需要丰富的经验。细菌的分离相对复杂，特别是往往一次能从病料中分离到很多种细菌和霉菌，甚至长了满满的一个平板，如何从这些菌落中挑出与疾病密切相关的菌落，然后针对性地进行生化试验，并非易事，这需要扎实的理论功底、丰富的实验技能和临床经验，当然先进的自动细菌测定系统，大大简化了上述步骤。
当然，如果是采用诸如PCR的方法来诊断，冷冻病料也同样可以使用，但是往往结果不理想。采用纯化后的细菌制备模板，进行PCR诊断，更容易得到准确的结果。另外，纯化的细菌可以进行进一步的药敏试验，指导临床用药。
2、病毒性疾病的病料采集和运送
因为病毒并不会因为有限次的冻融而死亡，因此可以冷冻的方式运送病料，这几乎不影响病毒的分离和检测。用于病毒性病原的诊断方法有很多，如间接免疫荧光试验、琼脂扩散试验、基因探针、聚合酶链式反应（PCR）等等。对于常规的一些病毒病原，PCR方法已经十分成熟，大多数的实验室也是采用这种方法进行检测的，从这个意义上讲，冷冻病料对于病毒病原的诊断没有任何影响，同时，因为用于这样运送的病料在采集时并不在乎细菌的污染，采集程序比较简单，只要切取相应的脏器组织的一部分就可以了。当然对于不同的病原，采集的脏器是不同的。淋巴结和其他免疫器官，通常是病料采集的首选器官。如检测CSFV最好采用扁桃体，检测PRRSV采用肺门淋巴结会好一些。这里需要指出的是，对于很对引起流产的病毒，我们很容易想到直接送检流产胎儿，但是很多时候这个选择并不理想，如PRRSV的检测，在实验中，我们就曾有多次不能从流产胎儿中检测到PRRSV，而可以从流产母猪体内检测到的例子。
3、血清学样品的采集和运送
抽血的方法，每个猪场都有自己的一套，总的只要把握一个原则，采集的血液尽量不受污染。其实用于检测的血清量并不需要太多，大约1ml血液析出的血清已经足够。一个建议是，用一次性注射器采血，采集了大约1ml后，稍稍抽出滑塞，然后套回针头套，室温下呈30度倾斜放置，待血液凝集后运送，最好在24小时内送达检测单位。有条件的猪场，也可以自己分离血清后保存或送检。

总之，强指向性的临床诊断和针对性的实验室检查的结合，可以大大帮助疾病的诊断和控制。以合适的方法，采集合适的病料，并以正确的方法运送，是实现正确诊断的必要条件。

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太好了
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许小红

感谢楼主分享实用资料！！！

dragonli97

不用客气， 谢谢两位对我的文章的认同，争取再多写一些。

binwang

理论实践的结合，实验和临床的结合，是我们中国兽医努力的方向！

wangliguo429

好资料，谢楼主，辛苦