归芪益母汤耐缺氧及抗氧化作用的实验研究

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归芪益母汤耐缺氧及抗氧化作用的实验研究 许小琴1韦旭斌1刘学忠2李金贵2胡仲明1柳巨雄1王治1张玉国1 （1.解放军军需大学 军事兽医系，吉林 长春 130062；2.扬州大学 畜牧兽医学院，江苏 扬州 225009）

摘 要：归芪益母汤经水提醇沉制成注射液，经腹腔注射给药，进行常压缺氧、减压缺氧、化学法缺氧实验和抗氧化实验以探讨归芪益母汤对小鼠耐缺氧和抗氧化能力的影响。结果表明，归芪益母汤注射液显著延长了缺氧小鼠的存活时间（P<0.01），其中常压缺氧存活时间延长110.21%，减压缺氧存活时间延长76.48%，化学缺氧存活时间延长240.87%，这提示归芪益母汤能够提高小鼠的耐缺氧能力。抗氧化方面，体内实验表明，能显著降低小鼠因急性缺氧再暴露所引起的MDA的产生（P＜0.01），体外实验表明，能拮抗H2O2诱导的溶血和抑制超氧离子（O2-）生成。     关键词：归芪益母汤；中药复方；耐缺氧；抗氧化 归芪益母汤是出自清代的一首用于治疗劳役过度所致气血俱虚及产后血瘀腹痛的方剂，全方由当归、黄芪、益母草3味中药组成，具有气血双补与活血化瘀功效，因药味组成较少，在临床上应用并不广泛。然而，我们在对其进行中药药理学实验时，却意外地发现该方具有极强的增强机体耐缺氧能力的作用，为了进一步确证其药效并阐明作用机理，本试验观察了该方对小鼠耐缺氧能力的影响及抗氧化作用。     1、材料与方法     1.1 材料     1.1.1实验动物清洁级ICR小鼠、雌雄各半，体重19~21g。由白求恩医科大学实验动物中心及扬州大学实验动物中心提供。     1.1.2 药品归芪益母汤注射液：中药当归、黄芪、益母草（购自吉林大药房），经15倍去离子水浸泡，煎煮2次（30min/次），过滤，合并两次滤液浓缩至密度为1.20~1.25，冷至30℃时缓慢加入乙醇，使醇含量达70%，充分搅拌，静置过夜，滤取上清液，水浴回收乙醇至无醇味，用蒸留水调至1g/ml生药，以40%氢氧化钠溶液调pH值至7.0，再3000r/min离心10min，取上清经高压灭菌消毒后备用。钠石炭：上海五四化学试剂厂出品；硫代巴比妥酸（TBA）：Sigma公司出品（上海试剂二厂分装），1，3，3-四乙氧基丙烷（TEP）：Sigma公司出品（上海试剂二厂分装）；30%双氧水溶液：上海焱晨实业有限公司出品；其它化学试剂均为国产分析纯。     1.2 实验方法     1.2.1 常压缺氧实验[1]     1.2.1.1急性实验将40只小鼠随机分成药物组和对照组，每组20只，两组小鼠按每10g体重0.2ml剂量腹腔注射分别给予归芪益母汤注射液和生理盐水，于给药后15min将每只小鼠置于盛有5g钠石灰的250ml广口瓶中，加盖密封，记录存活时间（从密封至停止呼吸的时间）。     1.2.1.2慢性实验将60只小鼠随机分成试药低剂量组、高剂量组及对照组，每组20只，给药各组小鼠每天分别给予归芪益母汤（2g/ml，制法同注射液）0.4ml/10g、0.2ml/10g体重灌胃，对照组给生理盐水，连续5天，于末次给药后30min将小鼠装瓶，作同上实验。     1.2.2 减压缺氧实验将20只小鼠随机分成药物组和对照组，每组10只按0.2ml/10g体重剂量腹腔注射，分别给予归芪益母汤注射液和生理盐水，于给药后15min将10只小鼠同时置于盛有50g钠石灰的2000ml打开盖的玻璃干燥器中，干燥器盖的气阀（关闭）用橡胶管通过玻璃平衡瓶（20000ml）与抽气泵相连，抽气达26.7kpa（200mmHg）时，停止抽气，将干燥器盖密封后，打开气阀，待干燥器与平衡瓶内气压平衡时关闭气阀开始试验，记录各小鼠存活时间。     1.2.3化学物质缺氧实验将30只小鼠随机分成药物组和对照组，每组15只，分别腹腔注射0.2ml/10g体重剂量的药物和生理盐水，15min后每鼠再腹腔注射10mg/kg体重剂量的氰化钾，记录存活时间（从氰化钾注射完毕至停止呼吸的时间）。     1.2.4红细胞和血红蛋白的测定取32只小鼠断尾失血造成人工血虚模型，于断尾时和失血24小时后，每鼠眼底采血25μl置于事先放有血细胞稀释液的指型管中，用AL818全自动血液分析仪（瑞士）进行红细胞数和血红蛋白量测定。在证实失血模型成功后，将小鼠随机分为2组，每组16只，分别给予试药（2g/ml）和生理盐水，按0.2ml/10g体重灌胃，连续7天。于末次给药后30min，再次采血测定。     1.2.5急性缺氧再暴露后丙二醛（MDA）生成试验     取30只小鼠随机分成药物组、生理盐水对照组和空白对照组，每组10只，前二组分别于缺氧实验前6h和30min按0.2ml/10g体重腹腔注射药液和生理盐水，到时间后，将二组小鼠置于4000ml干燥器中，加盖密封30min，再打开密封盖使小鼠暴露在空气中2h；空白对照组小鼠不作任何处理，三组小鼠分别采用断头采血分离血清，按改良八木国夫法[2]测定MDA。     1.2.6 H2O2诱导红细胞溶血试验     小鼠断头取血，用生理盐水洗涤3次，制成5%红细胞悬液。试管中分别加入80μl、40μl、20μl药液及40μl生理盐水，每组平行8管，再向每管加入5%红细胞悬液1ml，然后加入H2O2使其终浓度为2mmol/L，于37℃温育诱导溶血1h，离心取上清液，用生理盐水40倍稀释后，在756紫外可见分光光度计上测定波长415nm处的OD值。     1.2.7超氧阴离子（O2-）生成试验（邻苯三酚自氧化法测定）取50mmol/L Tris-HCL缓冲液（pH8.2）3ml于试管中，加入0.1ml药液（分别含生药60mg/ml和30mg/ml）或生理盐水，混匀后加入0.3ml的7mmol/L邻苯三酚，反应4min后加入150μl的10mol/L HCl终止反应，每组平行8管于420nm处测OD值。 　　实验数据用均数±标准差（）表示，采用ｔ检验进行组间差异统计。     2、结果     2.1常压缺氧存活时间     从表1可见归芪益母汤无论是急性腹腔注射或是慢性灌胃给药都能提高小鼠耐缺氧能力，分别与对照组间存在显著差异（P＜0.01），而灌胃给药高、低剂量组间无显著差异。 表1归芪益母汤对小鼠常压耐缺氧能力的影响（，n=20） 组别 剂量 （ml/10g） 给药 途径 存活时间 （min） 增加 率（%） 急性生理盐水组 0.2 ip 37.21±7.76 急性归芪益母汤组 0.2 ip 78.22±14.52* 110.21 慢性生理盐水组 0.2 ig 38.29±12.34 慢性高剂量药物组 0.4 ig 55.63±16.86△ 45.29 慢性低剂量药物组 0.2 ig 56.68±20.33△ 48.03 *急性组内P＜0.01，△慢性试验中药物组与生理盐水对照组间P＜0.01     2.2 减压缺氧存活时间     从表2可见归芪益母汤注射液腹腔注射能显著地延长小鼠在减压缺氧的存活时间，且药物组与生理盐水对照组比P＜0.01异显著（P＜0.01）。 表2归芪益母汤对小鼠减压耐缺氧能力的影响（，n=10） 组别 剂量 （ml/10g） 给药 途径 存活时间 （min） 增加 率（%） 生理盐水对照组 0.2 ip 14.67±3.65 归芪益母汤组 0.2 ip 25.89±4.67* 76.48 * P＜0.01     2.3 化学物质所致缺氧存活时间     从表3可见，归芪益母汤腹腔注射具有拮抗氰化钾抑制呼吸酶的作用，从而明显地延长氰化钾所致缺氧小鼠的存活时间，与生理盐水对照组比较具有极显著性差异（P＜0.01）。 表3归芪益母汤对小鼠耐氰化钾所致缺氧能力影响（，n=15） 组别 存活时间（min） 增加率（%） 生理盐水组 2.52±0.45 归芪益母汤组 8.59±2.71* 240.87 * P＜0.001     2.4 对血虚小鼠红细胞及血红蛋白的影响     由表4可见，血虚模型小鼠的红细胞数和血红蛋白与首日失血前的正常值间存在显著差异（P＜0.01），说明所建血虚模型成功。血虚小鼠给予归芪益母汤1周后，其红细胞数和血红蛋白的恢复率明显高于生理盐水对照组（P＜0.01），说明归芪益母汤具有促进血虚动物红细胞和血红蛋白增生的作用。 表4归芪益母汤对小鼠红细胞及血红蛋白的影响（，n=16） 组别 红细胞数 （1×1012/L） 红细胞恢复率（%） 血红蛋白（g/L） H恢复率（%） 正常组 8.12±0.76 140.83±12.53 血虚模型组 6.01±0.53* 114.46±11.22* 归芪益母汤组 7.81±0.48△ 96.18 137.83±13.22 97.87 生理盐水组 7.04±0.38 86.69 125.01±11.15 88.77 *血虚模型组与正常组比较P＜0.001，△归芪益母汤组与生理盐水组比较P＜0.01     2.5 对小鼠急性缺氧再暴露后MDA生成的影响     从表5可见，空白对照组与生理盐水组相比，MDA的生成有显著性差异（P＜0.01），说明小鼠急性缺氧再暴露后，体内脂质过氧化物的形成明显增加。而归芪益母汤组与生理盐组相比，MDA的形成显著减少，且有显著性差异（P＜0.01），但与空白对照组相比则无明显差异（P＞0.05）。说明归芪益母汤能够抑制小鼠因急性缺氧再暴露诱导的脂质过氧化增强的作用。 表5对小鼠急性缺氧再暴露后MDA生成的影响（，n=10） 组别 MDA(nmol/ml) 增生率（%） 空白对照组 13.87±3.70 生理盐水组 29.57±1.76△ 113.19 归芪益母汤组 15.93±1.37*○ 14.85     △生理盐水组与空白组比较P＜0.01，*归芪益母汤组与生理盐水组比较P＜0.01，○归芪益母汤组与空白组比较P>0.05。     2.6 对H2O2诱导红细胞溶血的影响     从表6可见，归芪益母汤对H2O2氧化红细胞膜诱导的溶血有显著的抑制作，且有明显的剂量依赖性，IC50为32.1mg/ml。 表6归芪益母汤对H2O2诱导小鼠红细胞溶血的影响（） 药物剂量 MDA(nMoL/ml) 增生率（%） 生理盐水组 0.936±0.030 归 芪 益 母 汤 40mg/ml 0.293±0.044* 68.70 20mg/ml 0.593±0.026* 36.65 10mg/ml 0.706±0.048* 24.59 *各药物组与生理盐水组比较P＜0.01     2.7 对超氧阴离子（O2-）生成的影响     从表7可见，归芪益母汤在体外对超氧阴离子的生成具有显著的抑制作用，并呈现明显剂量效应，60mg/ml剂量组与30mg/ml剂量组之间亦存在显著性差异（P＜0.01）。 表7归芪益母汤对O2-生成的影响（） 药物剂量 OD值（420nm） 抑制率（%） 生理盐水组 0.231±0.005 归 芪 益 母 汤 30mg/ml 0.151±0.003* 34.63 60mg/ml 0.095±0.008*△ 58.87 * 归芪益母汤组与生理盐水组比较P＜0.01 △60mg/ml组与30mg/ml组比较P＜0.01     3、讨论     3.1 归芪益母汤是以大补脾肺之气的黄芪为主，以当归养血补血，益母草活血祛瘀，是临床治疗劳役过度所致的气血俱虚及产后血虚、瘀滞腹痛等症的常用方剂。本次实验研究表明，归芪益母汤对小鼠的常压缺氧、减压缺氧、氰化钾所致组织缺氧等都有显著地延长存活时间的功能，与对照组相比都具有显著性差异。其中，效果是以腹腔注射给药法最理想，如常压注射组、氰化钾缺氧实验中分别提高耐受率达110.21%和240.87%。有关黄芪、当归[3-6]具有提高小鼠耐氧能的报道较多，但提高能力仅在25%~45%之间。说明归芪益母在提高小鼠耐缺氧能力方面和组方的合理性方面有独特之处。     3.2 正常动物体在有氧代谢过程中，氧化还原反应伴有超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（OH? ）乃至H2O2等自由基的生成。体内又存在酶及非酶类清除自由基的完整体系，能够直接清除自由基及其毒性。然而当动物体缺血缺氧时能引起组织呼吸受阻，能量代谢障碍等一系列变化，当丰富的血氧再供给时，可造成缺血、缺氧组织大量自由基的瞬时产生，从而远远超过机体清除自由基的能力，致使产生多量自由基而引起组织损伤及病理改变[2-8]。自由基可直接破坏细胞膜的成分，引起脂质过氧化瀑布效应，损伤膜结构及其功能。另一方面，可引发一系列自由基反应，形成的产物直接破坏蛋白质和DNA，使蛋白质和DNA交联而丧失活性功能，从而导致细胞死亡[9]。本文体外实验结果显示，归芪益母汤对O2-的产生有显著抑制作用，对H2O2氧化细胞膜所诱发的溶血亦具有明显的抑制作用；体内实验证实，归芪益母汤对小鼠缺氧后再暴露所引起的过氧化脂质代谢产物MDA的产生具有极显著的抑制作用，这说明归芪益母汤在体内能抑制自由基的产生，减少因自由基及其产物所引起的各种损伤，从而保证组织正常活力，这可能亦是其提高小鼠耐缺氧能力的分子机理之一，但作用的确切分子机理还需作进一步的研究探讨。